铁蛋白自噬在糖尿病及其相关并发症发病机制中的研究进展

石建梅 王茜茜 韦晓洁

1广西中医药大学基础医学院 （南宁 530299）；2广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室（南宁 530299）

糖尿病（Diabetes mellitus， DM）是一组由多种病因引起的以慢性持续性高血糖（hyperglycemia，HG）为特征的终生代谢性疾病，长期代谢紊乱和持续高血糖可逐渐加重患者肾脏、心肌、足部、视网膜、脑血管、神经系统等损伤，从而引发诸多并发症，目前我国已成为DM第一大国，严重危害公众健康［1-2］。铁蛋白自噬（Ferritinophagy）是指铁蛋白水平可以通过靶向铁蛋白的选择性自噬过程调节的一种细胞自噬方式，当细胞内铁离子水平下降时，核受体辅激活蛋白4（nuclear receptor coactivator 4， NCOA4）所介导的自噬受体与铁蛋白重链-1（ferritin heavy chain 1， FTH1）相结合，并被转送至溶酶体中降解，释放出游离Fe2+以供机体生理需求。在DM 的HG 条件下，会触发铁蛋白自噬相关信号通路，导致铁蛋白自噬异常，从而影响DM 及其相关并发症的发生与发展。因此，本文将主要从铁蛋白自噬的定义、铁蛋白自噬与铁死亡的关系、铁蛋白自噬与DM 及其相关并发症的关系3 个方面，对铁蛋白自噬在糖尿病及其并发症的发病机制中的研究进展进行综述，为未来在临床上以铁蛋白自噬过程为启发点开发糖尿病及其相关并发症的靶向治疗药物提供新的视角。

1 铁蛋白自噬的定义

自噬（autophagy）是一种重要的细胞内降解系统，通过吞噬错误折叠的蛋白质、受损的细胞器或胞内的病原体等形成自噬体，而后自噬体与溶酶体部分融合形成自噬溶酶体，利用溶酶体酶去降解受损、老化的细胞器中的内容物，以此保持胞内环境的稳定［3-4］。铁蛋白自噬是指铁蛋白的选择性自噬降解过程，是自噬的一种特殊类型，该过程以NCOA4 作为货物受体，可与铁蛋白结合并将其递送至溶酶体以进行铁蛋白降解和释放游离Fe2+，对细胞内铁的生物利用度至关重要［5］。铁是人体所需的一种微量元素之一，参与体内的诸多生化反应，所以铁含量如果不加以调控，便会导致铁稳态的失衡：过量的亚铁会通过芬顿反应产生活性氧（reactive oxygen species， ROS），从而导致细胞毒性；过量的铁以非氧化还原和稳定状态的Fe3+形式储存在铁蛋白中。铁蛋白是一种细胞内广泛存在的储铁蛋白，由FTH1 和铁蛋白轻链（ferritin light chain， FTL）等24 个亚基组成的复合物，可以积累4 500 个Fe3+，其中，FTH1 的核心螺旋结构可与细胞膜表面受体蛋白结合，而FTL 的核心螺旋结构则会与内体溶酶体蛋白相互作用，并通过自噬途径来实现铁蛋白的降解，当胞内游离Fe3+降低，铁蛋白就会被降解并释放出大量Fe2+，这一过程就是“铁蛋白自噬”［6］。简而言之，细胞内铁含量水平会影响铁蛋白的降解释放，当胞内铁离子浓度较高的情况下，可引起ROS 的积累，造成铁死亡；如果细胞内的铁浓度低于正常值，那么铁蛋白的降解速度会加快，而过量的铁离子也会被释放出来，从而导致铁蛋白自噬。

2 铁蛋白自噬的基本步骤

铁蛋白自噬过程主要包括3 个步骤：一是NCOA4 与铁蛋白的特异性结合；二是铁蛋白在自噬溶酶体中的降解；三是Fe2+的释放。MANCIAS等［7］在2014 年通过对纯化的自噬体进行蛋白质组学分析发现NCOA4 作为介导铁蛋白至自噬溶酶体中进行降解的受体，其C 末端与铁蛋白FTH1 表面的精氨酸残基R23 结合，促使与铁蛋白结合的铁离子释放成为游离铁，并将此过程被命名为“铁蛋白自噬”（ferritinophagy）。在研究中，研究者们发现NCOA4 是一种包含4 个结构域的蛋白质，即NCOA4α、NCOA4β、NCOA4-N 末端和NCOA4-C 末端4 个结构域，铁蛋白仅与NCOA4α 和NCOA4-C末端结合，因为这两个片段上存在含铁蛋白高度特异性结合位点；W497、I489、S492、L494 和L498是NCOA4 与铁蛋白结合的重要残基，特别是当NCOA4 与FTH1 的结合时，I489/W497 是铁蛋白自噬过程中不可缺少的两个残基；不仅如此，FTH1-R23 对于铁蛋白与NCOA4 的结合也是至关重要的，当FTH1-R23 发生基因突变时，铁蛋白就无法与NCOA4 结合，这说明在铁蛋白自噬过程中，NCOA4 和FTH1-R23 是必不可少的结构［8-9］。铁缺乏的状态下，NCOA4 通过与铁蛋白FTH1 亚基特异性结合，形成NCOA4-Ferrin 复合体，将铁蛋白送入溶酶体进行降解，与自噬相关因子8（autophagy related gene，ATG8）结合后，逐步形成自噬溶酶体，使胞内Fe2+含量升高，最终介导铁蛋白自噬并增加细胞中的铁含量［10］；而当铁过量时，NCOA4 与HERC2 泛素连接酶结合并通过蛋白酶体降解，但HERC2 泛素连接酶仅在胞内铁处于高水平时才与NCOA4 结合［9］。综上所述，铁蛋白自噬是一个极其复杂的过程，此过程，FTH1 和NCOA4 是不可缺少的两个关键物质，这些蛋白在维持细胞内环境稳定及许多生理病理过程中发挥着关键作用。铁蛋白自噬具体机制如图1。

图1 铁蛋白自噬机制图Fig.1 Mechanism of ferritinophagy

3 Fe2+水平是启动铁蛋白自噬的关键环节

铁是各种细胞生化反应所必需的微量元素，在细胞中常以Fe2+和Fe3+两种形式存在。其中，亚铁具有高反应性，参与各种细胞生化反应，比如氧化磷酸化、代谢物合成和氧运输等。然而，过量的亚铁会通过芬顿反应产生ROS，从而导致细胞毒性，引起铁死亡；胞中多余的铁将以非氧化还原和稳定状态的Fe3+形式储存在铁蛋白中；当细胞因生化反应对Fe2+的需求增加时，铁蛋白将发生自噬，而后Fe2+被降解释放到细胞质中［3］。因此，铁含量在胞内必须受到严格调控。铁蛋白自噬是一种经NCOA4 介导，铁蛋白被降解，而后释放Fe2+的自噬过程，该过程可以增加胞内游离铁的利用率，由此可见，铁蛋白自噬过程不仅受细胞内Fe2+含量的调节，而且Fe2+水平是启动铁蛋白自噬的关键环节［5］。尤其是在铁缺乏的条件下，FTH1 表面的精氨酸残基R23 可与溶酶体上的NCOA4 结合并将其递送至自噬体，继而转运至溶酶体，形成自噬溶酶体，铁蛋白经降解后，Fe2+被释放以补充铁水平［11］。由此可见，大多数铁离子都储存在铁蛋白中，而铁蛋白会在需要时被溶酶体降解，并释放游离铁，从而启动铁蛋白自噬过程。

4 铁蛋白自噬与铁死亡的关系

多项研究发现，NCOA4 介导铁蛋白自噬过程是细胞中可用铁的反馈调节机制，NCOA4 的激活会增加细胞中可用铁的含量［8，12］。这种调节不是单向的，细胞内铁水平也会影响铁蛋白自噬通量［7］。例如在铁充足或急性铁过载条件下，E3 泛素蛋白连接酶2 以泛素依赖性方式介导NCOA4 的降解，通过减少铁蛋白吞噬通量从而平衡铁水平［9］；在铁缺乏的条件下，NCOA4 与E3 泛素蛋白连接酶2 结合减弱，NCOA4 蛋白酶体减少，继而导致NCOA4 水平升高，细胞内游离铁的含量增高，从而促进铁蛋白自噬。另外，GRYZIK 等［13］在研究中发现，每个铁蛋白复合物可以结合多达24 个NCOA4 分子，NCOA4 的含量高低是决定铁蛋白自噬通量的关键要素，因此有研究将NCOA4 确定为铁死亡的关键调节因子，当NCOA4 耗尽时可减少细胞中的游离铁和氧化应激反应，同时增加谷胱甘肽水平［7，14］。此外，铁蛋白自噬可介导多种细胞的铁死亡过程。有研究［15-16］表明，过量的铁蛋白自噬可以使神经元中产生大量的游离铁，从而造成溶酶体中的铁过载，从而引起溶酶体中的脂质过氧化应激，加速神经元的铁死亡，从而引起阿尔茨海默病和帕金森病等多种神经系统疾病。有动物研究证实，在SAH 大鼠模型中，铁蛋白自噬可降解神经元中的铁蛋白，造成细胞内铁稳态破坏，促进神经元铁死亡，加重蛛网膜下腔出血后早期脑损伤［17］。此外，在肿瘤细胞中激活铁蛋白自噬诱导Fenton 反应，胞内ROS 水平升高，进而诱导细胞铁死亡［18-19］。上述研究提示，铁蛋白自噬所致的铁超载是铁死亡的直接驱动因素。

5 铁蛋白自噬在糖尿病及其相关并发症发病机制中的研究进展

5.1 铁蛋白自噬与糖尿病在糖尿病发展进程中，葡萄糖代谢与铁代谢密切相关，当胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗时血液中葡萄糖升高，在高血糖状态下会导致铁超负荷，引起铁蛋白自噬，过量的铁不仅会使胰岛素发生抵抗，而且其可通过fenton 反应催化有毒的羟基自由基产生，导致ROS积聚，从而诱导氧化应激，最终诱发铁死亡［20-21］。研究［20］发现，桑叶提取物隐绿原酸（cryptochlorogenic acid， CCA）对糖尿病模型大鼠的血糖、血铁含量、脂质过氧化物积累及胰岛损伤均有浓度依赖性改善作用，其可通过激活XC-/GPX4/NRF2 通路，抑制NCOA4活化，继而阻止高糖诱导的胰岛细胞铁死亡，最终对糖尿病起到保护作用。高糖高脂饮食会损害小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性；相较于野生型小鼠，FTH1 基因敲除小鼠脂肪组织铁含量明显降低，脂肪组织中炎症细胞因子、浸润性巨噬细胞和氧化应激反应亦明显减少，同时小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性得到改善，提示铁自噬底物FTH1介导的铁代谢紊乱可能是肥胖和糖尿病的始动因素［21］。HAMAD等［22］通过分析糖尿病患者胰岛铁代谢基因表达谱发现，糖尿病患者胰岛中FTH1、FTL 表达高于非糖尿病人群，体外过表达FTH1、FTL 可诱导胰岛细胞INS-1 中ROS 累积，导致胰岛细胞死亡，使胰岛素分泌减少。通过此研究，我们可以猜想铁蛋白自噬导致糖尿病发生发展的机制可能为：各种原因引起的高血糖诱发FTH1、FTL 的高表达，引起铁蛋白自噬后释放过量的铁，从而诱导胰岛细胞INS-1中ROS累积，从而诱导氧化应激，然后诱发铁死亡，最终导致胰岛细胞死亡，使患者发生糖尿病；而糖尿病则进一步加剧了高血糖的发生，使病情进一步发展。若通过寻找有效抑制FTH1、FTL 的过表达的靶向药物，便可间接调控铁蛋白自噬，进而延缓DM 的发展。

5.2 铁蛋白自噬与糖尿病肾病（diabetic nephropathy， DN）DN 是糖尿病患者最常见的微血管并发症，其发病率在T1D 患者、T2D 患者中约为30%和40%，早期有报道显示，DM患者肾脏微血管的改变可引起糖尿病肾病［23］。现有证据［24］表明，铁蛋白自噬是DN 发病机制中的关键环节，其可通过破坏细胞铁稳态参与DN 的发展进程。研究［11］发现，DN 模型大鼠肾脏组织可见铁死亡的典型特征表现，例如铁含量增加、氧化应激及脂质过氧化等。足细胞是肾脏组织的重要固有细胞，其结构完整是维持肾小球滤过功能的前提条件。研究［25］证实，足细胞是高糖作用的主要靶细胞，高糖刺激下足细胞内ROS 累积明显，Fe2+水平增高，而GPX4、FTH1 表达减少；银杏叶有效成分银杏内酯B 可通过上调GPX4、FTH1 表达，减少高糖诱导的足细胞损伤，并改善DN 模型小鼠肾脏组织病理学变化，减少肾组织铁含量及尿白蛋白含量，这表明，在DN 中铁死亡的发生与铁蛋白自噬引起的铁超负荷有关。铁与DN 的病理生理过程有着密切的联系，当出现铁过载时，过多的铁会诱发通过芬顿（Fentom）反应产生大量ROS，引发一系列氧化应激反应及激活多种细胞因子、转录因子和炎症介质，引起肾小球细胞外基质沉积，最终导致肾纤维化；它还会降低机体的抗氧化能力，进一步加重肾损伤，加速DN 的发展［26］。肾小管损伤是DN 的主要病理学改变。研究［27］发现，高糖诱导下肾小管上皮细胞HK-2 增殖活性减弱，同时NCOA4 表达升高、GPX4 表达降低；无论在体内或体外，毛蕊异黄酮均对肾小管上皮细胞具有保护效应，其可通过调节NCOA4、GPX4 表达，抑制铁蛋白自噬，减少细胞内ROS 累积及脂质过氧化反应程度，继而改善高糖介导的肾小管上皮细胞铁死亡。综上所述，我们或许可以得到一个结论：在HG 环境下，会出现ROS过度积累、铁超载、NCOA4水平升高，而GPX4、FTH1 表达减少，最后导致肾损伤，从而加速DN 的发病进展，因此当使用靶向药物调控铁蛋白自噬过程时，相关因子水平可得到有效缓解。虽说诸多研究显示，铁蛋白自噬在DN 的发病机制中起重要作用，但相关靶向药物作用于铁蛋白自噬中的某条信号通路或者某个相关因子的机制却未有详尽的阐明，这也为未来探寻铁蛋白自噬在DN 的发病机制中的作用提供了一个全新的思路。

5.3 铁蛋白自噬与糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy， DCM）DCM 是糖尿病的严重并发症和死亡原因，可导致12%的糖尿病患者出现心力衰竭和死亡。有研究证实，经铁蛋白自噬所激活的铁死亡与DCM 心肌细胞损伤密切相关，动物研究显示，造模12 周后DCM 模型小鼠心功能障碍明显，主要表现为心肌组织纤维化、心脏泵血功能减弱，同时心肌细胞出现大量铁死亡，ROS累积、内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）加剧；亚精胺可调控ERK1/2 信号通路，抑制NCOA4 介导的铁蛋白自噬，减少心肌细胞脂质过氧化和铁死亡，逆转高糖介导的心肌损伤过程［28-29］，这说明通过调控ERK1/2 信号通路可对心肌细胞产生保护作用，阻止细胞发生铁蛋白自噬。在另外一项研究［29］中发现，相较于正常对照组，DM 模型大鼠血糖明显升高，心肌组织FTH1、NCOA4、LC3-Ⅱ表达及铁含量上调；去铁胺处理1 周后可降低糖尿病大鼠血糖及心肌损伤标志物cTnI 水平，抑制心肌组织NCOA4 表达，进而改善心肌细胞损伤。以上实验研究均表明在HG 的刺激下，心肌细胞的均会受到不同程度的损伤，并伴随着铁蛋白自噬相关因子水平的升高，但经相关药物调控后，可使铁蛋白的选择性货物转运体NCOA4 表达受到抑制，最终抑制铁蛋白自噬降解，使心肌细胞受到保护。那么寻找更多的靶向药物来调控铁蛋白自噬，进而达到细胞保护作用，延缓DCM 的病程变得越来越重要。

5.4 铁蛋白自噬与糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer， DFU）DFU 是一种难治性慢性创伤，约有19% ～ 34%的糖尿病患者会发生DFU，其病死率高达40%，严重的感染发作及截肢是导致DFU患者死亡的主要原因，随着DM 患病率的增加以及社会人口老龄化等多因素的影响下，DFU的患病率也在逐渐升高［30-31］。在高糖诱导的糖尿病小鼠模型中发现，糖尿病伤口组织中的铁蛋白表达明显上调，NCOA4 的蛋白质表达显著降低，FTH1 mRNA 表达也降低，这表明可以通过调节NCOA4 的表达来改变衰老细胞中的细胞内铁蛋白和铁离子，继而减少铁蛋白自噬过程，促进伤口的愈合［32］。此外，有研究［33］证实芍药苷具有减轻氧化应激，增加细胞增殖，减少细胞凋亡以及增加VEGF 和TGF-β1 的表达的作用，其可通过激活Nrf2 途径来加速DFU患者伤口愈合的能力。上述研究说明铁蛋白自噬过程与DFU密切相关，深入探寻铁蛋白自噬在DFU发病机制中的作用，可为DFU 的靶向治疗提供新思路。

5.5 铁蛋白自噬与糖尿病性脑血管病（diabetic encephalopathy， DE）DE 是DM 中枢神经系统并发症之一，DE 被定义为DM 引起的认知障碍和大脑神经生理或结构改变，它与中枢神经系统的退化和功能障碍密切相关，DE 主要表现为学习和记忆障碍，最终可能导致痴呆；目前DE 的发病机制尚未完全阐明，但DE 与脑血管异常、氧化应激和胰岛素异常有关已得到证实［34］。有研究［35］显示，DM 患者的长期高血糖刺激可能会导致脑毛细血管异常，并改变血脑屏障的脑内皮细胞功能，这些微血管变化可能会引起慢性或隐性脑缺血，导致认知能力下降；另外HG 影响下，脑组织通过多元醇和己糖胺途径增加对葡萄糖的吸收、使ROS 水平失衡以及产生高级糖基化蛋白，从而导致认知障碍，促进DE 的进展。帕金森病（PD）是一种进行性神经系统疾病，其神经病理学特征是易损脑区的多巴胺能神经元丢失，尤其是黑质上的神经元；当铁离子发生超负荷时，可诱发多巴胺能神经元的毒性，并促进α-突出核蛋白聚集，从而引发以NCOA4 介导的铁蛋白自噬降解，释放过量的铁离子，最终导致细胞铁死亡；动物研究显示，通过抑制PD 小鼠模型NCOA4 的表达，可降低铁蛋白自噬的降解，减少细胞内铁含量的增加，脂质ROS也随之减少，最终防止细胞铁死亡，该研究［15］表明铁蛋白自噬所引发的铁死亡与多巴胺能神经元的神经毒性有关，通过抑制细胞铁蛋白自噬可有效防止细胞发生铁死亡，这可能是未来防止PD 的新策略。

5.6 铁蛋白自噬与糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy， DR）随着糖尿病的发生率在世界范围内越来越高，DR 也随即成为了DM 最常见和最严重的眼部并发症［23］，是糖尿病患者视力障碍和失明的主要原因，大约有75%的DR 患者出现不可逆的视力丧失［36］。DR 发病过程中有着诸多病理变化，但其早期主要以血管细胞丢失、血管渗漏以及血-视网膜屏障（blood-retinal barrier， BRB）遭到破坏为病理特征，而越来越多的研究［36］显示，氧化应激以及炎症在DR 的发生发展中起着重大作用。例如，在一项以人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19 建立DR 模型的研究表明，在DR 和氧化应激期间，会发生线粒体应激和损伤，这些应激和损伤需通过线粒体自噬消除，而新线粒体的生物合成需要铁蛋白自噬参与；而通过人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19 建立的模型发现，HG 导致受损的线粒体通过线粒体自噬流向溶酶体，同时激活铁蛋白自噬并释放Fe2+，游离的Fe2+与H2O2通过芬顿反应通过产生过量的ROS，攻击膜脂质，从而破坏BRB 的膜完整性并导致血管渗漏［37］。这表明在HG 和DR 的双重条件下，会出现线粒体损伤及其功能障碍，与此同时触发铁蛋白自噬，导致ROS 和Fe2+的过度累积，从而加重DR 视网膜的损伤，最终加速了DR 的病程进展，这明确了铁蛋白自噬参与DR 的发生发展的事实，但其参与DR 的具体机制未得到进一步明确。这也为未来寻找防治DR 的靶向药物提供了一个思路，比如探索铁蛋白自噬参与DR 的某条具体信号通路或某个特定信号靶标，从而寻找通过调控铁蛋白自噬的信号通路或相关因子的药物来延缓DR 的病程。另外，有研究［38］表明，Ferritinophagy 作为铁死亡的关键调节过程，其在DR 的发病机制中发挥着重要作用，并且该研究通过采用GSE146615 数据集鉴定出了8 个潜在的铁蛋白自噬相关差异表达基因，即HERC2、ATG16L1、WDR45、BCAT2、FBXW7、BECN1、TNF 和ATG7，其结果证实BECN1 是DR 中铁蛋白自噬的潜在靶标并推测ATG7 和BCAT2 也参与DR 的铁蛋白自噬过程。由此研究我们可得知，虽然已知多个铁蛋白自噬相关差异表达基因参与了DR 的病程进展，但这些基因参与DR 的具体机制及作用尚未得到近一步验证，因此还需要更多的相关研究来阐明这些相关基因在DR 中的作用。

5.7 铁蛋白自噬与糖尿病自主神经病变（diabetic autonomic neuropathy， DAN）DAN是DM患者的一种严重且常见的并发症，但它是DM 中最不为人知并了解的并发症之一，DAN 是DM 伴发的周围性多发性神经病的一种亚型，可累及整个自主神经系统（ANS），它表现为一个或多个器官系统，例如心血管系统、胃肠道系统、泌尿生殖系统、泌尿生殖系统及出汗异常等，DAN 的临床症状通常要等到DM 发作后很长时间才会出现。有研究［39］显示，在DAN中以心脏自主神经系统病变（diabetic cardiovascular autonomic neuropathy， DCAN）危害最大，DCAN 会引起无痛性心机梗死，甚至死亡。HG被认为是引发CAN的罪魁祸首，HG 导致线粒体功能发生障碍，ROS 形成，并诱导DNA 损伤，经过一系列途径，最终引起腺嘌呤核苷三磷酸耗竭、自主神经脱髓鞘和神经元死亡，最终出现典型的CAN；不仅如此，HG 还会干扰神经元的再生，活性氧增加可能通过抑制自主神经节突触的传递，增加致命性心律失常及心梗后猝死的风险［40］。目前针对铁蛋白自噬在DAN 的发病机制中的作用研究鲜少，针对铁蛋白自噬通路防治DAN 的靶向药物还尚未完全开发，对此，以铁蛋白自噬为出发点，寻找防治DAN的药物或是一个有望探寻的视角。

6 总结

糖尿病及其相关并发症的发病机制复杂，临床上尚无有效的防治手段，已成为重大的公共卫生问题。大量证据表明，铁蛋白自噬与糖尿病及其相关并发症密切相关，但目前针对铁蛋白自噬的调控机制、信号网络及对疾病影响的研究尚处于起步阶段，未来仍需进一步探索铁蛋白自噬的分子生物学机制及信号调控网络，以期为糖尿病及其相关并发症的靶向治疗提供新思路和新方向。