HOXB4基因表达水平在骨髓增生异常综合征中的临床意义

王怡晨 严燕雯 宋美慧 薛祥俊 周文广 李玉权 齐玲 李光华 曾祥宗，

1大理大学基础医学院（云南大理 671000）；广州医科大学附属第六医院，清远市人民医院2消化病研究所，3血液病科（广东清远 511518）

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome， MDS）是一种起源于造血干细胞的异质性髓系肿瘤，以骨髓无效造血、病态造血和高风险向急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）转变为特征［1］。MDS 的总体2 年生存率约65%［2-3］。其中，20% ～ 30%患者会出现AML 转化，此时治疗难度比原发AML 还要高，中位生存期不到1年［4-5］。MDS 向AML 转化涉及多种机制，如基因突变、染色体不稳定性、表观遗传改变、免疫缺陷及骨髓微环境改变等，但其确切机制尚不明确［6-7］。近来，有文献［7-8］报道与造血干细胞的自我更新及分化命运相关的转录因子在MDS 向急性白血病转化中扮演着重要角色，如RUNX1、GATA2 等［9-10］。同源盒基因（homeobox gene，HOX）是调控造血干细胞增殖、分化的高度保守的同源域转录因子家族。其中，HOXB4 是调控造血干细胞自我更新的重要正向因素［11］。ANTONCHUK 等［12］发现过表达HOXB4 基因可以使得具有造血潜能和分化能力的造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC）快速增殖。李琳等［13］发现，HOXB4 基因的表达水平与AML 患者肿瘤负荷存在正相关，高表达HOXB4 患者的化疗效果差。然而，这些研究主要聚焦在正常造血干细胞的扩增以及肿瘤化疗耐药上，关于HOXB4 基因在MDS 患者中的临床意义既往少见报道。为此，本研究拟通过检测MDS 患者骨髓样本中HOXB4的表达水平，探讨其在MDS疾病进展中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2021 年7 月至2023 年6 月在广州医科大学附属第六医院（清远市人民医院）血液内科诊断为MDS 患者49 例（MDS 组），其中男26 例，女23 例，年龄25 ～ 82 岁，中位年龄63 岁，按照WHO 2016 分型标准［14］分型。参照修订版国际预后评分标准［15］（international prognostic scoring system-revised，IPSS-R）对患者进行评分，不伴原始细胞增多类型（none excess blasts， Non-EB）患者25 例，伴原始细胞增多类型（excess blasts，EB）患者24 例。纳入同时期就诊的35 例非恶性血液系统疾病患者（巨幼细胞性贫血24 例，缺铁性贫血11 例）作为对照组（C 组），C 组中男16 例，女19 例，年龄24～85 岁，中位年龄59 岁。为进一步探讨HOXB4 基因的表达水平与临床特征的关系，我们根据HOXB4 的中位表达水平分为高表达组和低表达组，其中HOXB4 高表达组24 例，低表达组25 例，参照IPSS-R 对患者进行评分，以4 分为界限划分为相对低危组和相对高危组。本研究经清远市人民医院医学伦理委员会批准（伦理审查号：2023-研-135）且患者本人知情同意。

1.2 主要仪器及试剂Ficoll-Paque PLUS 淋巴细胞分离液（美国GE 公司），TRIzol 总RNA 提取试剂（美国Invitrogen 公司），逆转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），iTaq Universal SYBR Green Supermix（美国BIO-RAD 公司）；通过NCBI查找HOXB4 基因全序列，使用Primer premier 6软件设计特异性引物（表1）。通过BLAST 比对合格后，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。T100 梯度PCR 仪（美国BIO-RAD 公司）和 CFX96实时荧光定量PCR 仪（美国BIO-RAD 公司），Nano-Drop One 超微量分光光度计（美国赛默飞公司），全自动数字玻片扫描系统（德国ZEISS 公司）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 骨髓单个核细胞的分离使用EDTA 抗凝的采血管采集患者骨髓液4 ～ 5 mL，Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞，用于后续实验。

1.4 RNA 的提取及cDNA 的合成TRIzol 法提取骨髓单个核细胞中的总RNA，超微量分光光度计测定A260/A280处的吸光度值，记录吸光度值在1.8 ～2.2 之间的样本的RNA 浓度，进行cDNA 的合成。逆转录按照试剂商提供的说明书进行。取500 ng RNA、1 μL逆转录酶、4 μL 5×逆转录缓冲液，dd H2O补齐至反应体系20 μL。55 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s。待反应结束后将产物置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测HOXB4表达水平实时荧光定量PCR 按照试剂盒说明书进行。iTaq Universal SYBR Green Supermix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL，总反应体系20 μL，每一份标本做3 个复孔用来检测。在CFX96 实时荧光定量PCR 仪上进行扩增反应：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s 进行40 次循环，扩增完成后进入溶解曲线程序：65 ℃ 60 s。待所有反应结束后，以GAPDH 为内参，对HOXB4基因的表达水平进行标准化处理。根据Cq 值来计算△Ct 值，基因表达水平根据公式△Ct = Ct（待测基因）-Ct （GAPDH）进行计算，计算结果最终以2-（ΔΔCt）值来代表基因的表达水平。

1.6 统计学方法使用SPSS 21.0 统计分析软件，连续变量以±s表示，偏态分布资料以M（P25，P75）表示，采用独立t检验或Mann-WhitneyU检验，分类变量以n（%）表示，采用Fisher 精确值检验或χ2检验。以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MDS 患者HOXB4 基因表达水平MDS 组骨髓中HOXB4 基因的mRNA 中位表达水平为3.30（1.61，7.80），C 组的HOXB4 基因的mRNA 中位表达水平为1.43（0.61，3.12），与C 组相比，MDS 患者骨髓中HOXB4 基因的mRNA 表达水平显著升高（Z = -3.307，P= 0.002）。

2.2 HOXB4 基因表达水平与患者临床特征之间的关系HOXB4 基因高表达组白细胞的水平更低（P= 0.049），中性粒细胞水平有下降的趋势（P= 0.064），两组之间血红蛋白浓度及血小板数量差异无统计学意义（P= 0.342），见表2。

表2 MDS 患者的临床特征Tab.2 Clinical characteristics of patients with MDS

2.3 HOXB4 的mRNA 表达水平与MDS 分型的关系HOXB4 高表达组患者具有较多的EB 类型（P＜ 0.01），见表3。进一步分析发现，Non-EB 组患者HOXB4 基因的mRNA 中位表达水平为2.28（1.13，5.02），与C 组无差别（P＞ 0.05），而EB 组患者HOXB4 基因的mRNA 表达水平为6.45（1.77，10.89），相较于Non-EB 组患者（P＜ 0.01）和C 组（P= 0.001）均升高，差异有统计学意义。

表3 HOXB4 基因与MDS 分型的关系Tab.3 The relationship between HOXB4 gene and MDS classification 例（%）

2.4 HOXB4 表达水平与MDS 预后危险分层的关系HOXB4 基因高相表达组有19 例（79.2%）评为相对高危组，而低表达组只有13 例（52%）评为相对高危组，两组差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表4。

表4 HOXB4 基因表达水平与MDS 患者预后的关系Tab.4 The relationship between HOXB4 gene expression level and prognosis of MDS patients例（%）

2.5 HOXB4 基因表达水平与白血病转化之间的关系通过随访发现有10 例已进展至AML 阶段，其中8 例（33.30%）来自于HOXB4 基因高表达组，2 例（8%）来自于HOXB4 基因低表达组，HOXB4 基因高表达组患者的白血病转化率明显高于低表达组（P＜ 0.05），见表4。

3 讨论

MDS 是一组起源于造血干细胞的高度异质性的髓系恶性肿瘤，不同患者之间的临床表现相差很大，对于IPSS-R 评分为极低危的患者，临床可仅表现为轻度血细胞减少，中位生存期可长达9 年，而评分为极高危的患者则表现为严重的血细胞减少、快速向AML 转化，中位生存期不到1 年。目前研究［6-7］表明，由于造血干细胞本身遗传损伤事件的累积及骨髓微环境的免疫失调，高危患者MDS干细胞往往表现为快速增殖但分化阻滞，导致病情逐渐向急性白血病转化。这一过程中，调控造血干细胞增殖及分化的转录因子也起着重要作用［16］。在本研究中，我们发现与C 组相比，MDS 组的造血调控因子HOXB4 mRNA 表达水平升高，并且HOXB4 基因的高表达与患者白细胞减少、原始细胞增多、不良预后分层及白血病转化相关。

HOXB4 是第一个被证实在人类和小鼠中具有调控正常造血干细胞的自我更新和定向分化作用的HOX 基因。然而，HOXB4 不单有重要的造血调控作用，在许多恶性肿瘤中被认为是一种癌症相关基因，如白血病、乳腺癌、卵巢癌等［17-19］。KUSAKABE 等［20］发现在人类急性T 淋巴细胞白血病中，HOXB 基因通过可通过表观遗传机制被特异性激活，并使白血病前期细胞和白血病细胞具有生长优势，从而促进疾病的发生发展。ZHANG等［21］曾报道狗和猕猴在移植过表达HOXB4 的CD34+细胞后发生急性髓性白血病，这些白血病细胞存在过表达HOXB4、癌基因表达失调和髓系分化受阻，HOXB4 敲低后，白血病细胞可恢复分化。这些研究表明HOXB4 过表达具有显著的白血病发生风险。然而，目前关于HOXB4 在MDS 中的作用罕见文献报道。本研究发现MDS 患者中的HOXB4 基因表达水平与原始细胞比例及白血病转化相关。因此，我们推测HOXB4 的高表达可引起恶性原始细胞扩增，从而加速MDS 患者向急性白血病转化。

HOXB4 的异常表达常常与肿瘤的不良预后相关。有研究［22-24］发现在急性和慢性髓系白血病患者中，HOXB4 的高表达均与高肿瘤负荷、化疗耐药及不良生存期相关。而HOXB4 的敲低可通过PI3K/Akt 信号通路下调P-gp、MRP1 和BCRP 的表达，从而逆转白血病细胞株的多药耐药［25］。在卵巢癌中，HOXB4 可通过激活DHDDS 基因增强肿瘤细胞的增殖和侵袭，从而促进疾病恶性进展［17］，而HOXB4 敲低可通过抑制PI3K/Akt 通路下调ABC转运蛋白，增强紫杉醇和DDP 的细胞毒性作用从而达到增强药效的目的［26］。尽管已经有许多研究证实了HOXB4 基因的高表达可促进恶性肿瘤进展，但其确切机制目前尚不清楚，需要更多的研究去进一步阐明。

MDS 是一组异质性很大的疾病，患者的治疗策略主要依赖于预后风险分层［27］。现有的评分系统包括分子国际预后评分系统（IPSS-M）、IRSS-R及WHO 分型预后积分系统（WPSS）等都存在一定的不足，如所需的参数较多、评分过程较为复杂等。因此，发现新型可靠又易于检测的预后分子标志物对MDS 的诊治具有十分重要的临床意义。本研究发现骨髓单个核细胞中HOXB4 基因的高表达与MDS 的疾病进展密切相关，检测HOXB4 的表达水平，有利于临床及早发现白血病转化的高危人群，尽早启动去甲基化治疗、联合化疗及骨髓移植等积极治疗手段，改善患者的生存。此外，实体瘤中有基础研究表明HOXB4 敲低可以增强化疗疗效，因此，HOXB4 也有望成为治疗MDS 的潜在靶点。