诺奖得主阿诺德的新方向：培育优化酶

编译/舒愉棉

弗朗西斯 · 阿诺德（Frances Arnold）因开创性的酶定向演化技术而获得2018年诺贝尔化学奖，该技术使酶能被应用于横跨医药、消费品、农业、燃料和化学品生产的可持续化学领域。阿诺德现任加州理工学院化学工程、生物工程和生物化学专业的莱纳斯 · 鲍林教授[加州理工学院为纪念著名科学家莱纳斯 · 鲍林（Linus Pauling）而命名的教授职位]。2021年，现任美国总统拜登任命她为总统科学技术顾问委员会（PCAST）联合主席。阿诺德曾被美国前总统奥巴马授予美国国家技术与创新奖章。在2023年国际卓越研究论坛上，她围绕用于工程改造酶从而赋予其新功能的演化工艺做学术报告。在本次采访中，她与《美国科学家》（American Scientist ）杂志主编费内拉 · 桑德斯（Fenella Saunder）探讨她最新的研究成果。

弗朗西斯·阿诺德

如何为“定向演化”这一概念下定义？

20世纪80年代，当我开始从事蛋白质工程师这一工作时，没人知道获得优化蛋白质的规则是什么——优化意味着蛋白质能够执行人类感兴趣而非携带它的生物体感兴趣的功能。没人知道氨基酸序列与蛋白质功能之间的映射关系，我们也不知道这在酶中是什么情况，更不知道哪些编码能产生特定功能。如今我们知道了怎么解读DNA，能对DNA测序；我们知道了怎么写入DNA，能合成DNA；我们知道了怎么编辑DNA。但我们不知道如何组合DNA，而这个问题在演化中已经被解决得非常非常好了。所以为了克服我们对DNA序列和编码在酶中的作用几近一无所知，我决定采用已经被证明非常有用的自然进程——演化。我所做的，就是主导酶的演化。

定向演化早在20世纪80年代就通过分子生物学的技术实现了。我将这三种技术凑到了一起：因易出错从而能在基因中制造突变的PCR技术（聚合酶链式反应，一种复制DNA的方法）、能将这些突变基因整合到微生物中并且能表达出突变蛋白质的DNA重组技术以及能半高通量进行筛选的技术。首台能够观察96孔板的光谱仪问世于20世纪80年代末，因此我将这些零件拉扯到一起，开始筛选突变蛋白库并寻找有益突变，再将这些反馈到迭代了的流程中，即酶的演化优化。你猜怎么着？效果非常好。

自然选择产生的并不总是最佳的适应产物，而是那些刚好能承受选择压力的生物。这是否是定向演化能产生新功能的一部分原因呢？

诚然，要是没有进步的空间，演化也不会行得通，对吧？如果你已经处于最佳状态了，那么给予任何干预都不会起作用，这样要走上坡路就很难。但是如果人为改变了适配标准，那么全景图谱中其他部分峰值的相关适配度就被降低了，这就为进一步优化创造了空间。人为改变适配标准就是我们在让酶演化从而去完成一些非自然任务（就是那些酶普遍不热衷去完成的任务）时所做的事情，这至关重要。我们通常发现改进酶的天然功能或自然环境很困难，但通过改造酶，让它们去完成一些自然所赋予不同的任务时，事情就真的很简单了。

在靶向突变区域时，您是否并非随机引入突变，而是融合了您对蛋白质和生物酶的博学广识呢？

人们以为自己掌握了规则（或者至少是一部分规则），所以常常倾向这样去做。但这不就把惊喜给排除在外了吗？所以，当我们尝试要改变底物特异性时，我们确实常常会靶向生物酶的活性位点。但我们也注意到，当进行随机突变时，我们会发现其他额外的有益突变，这些突变的效果我们能观察到，却无法解释。如果不进行更广泛地观察，你就会错过学习和意外收获的机会。

每个人都倾向于靶向突变，因为筛选所有的酶变异体很痛苦，而人们认为自己已知的优于随机的。但有时候我们已知的并不优于随机的，这就是有意思的部分了。

当您发现了自己无法解释的有益突变，这是否意味着理论的不完整呢？

让我们试着把视角带回到20世纪80年代。那时候的理论非常有限，对吧？我们所用来了解突变效应的工具极为有限。人们会说，好吧，蛋白质的表面对于其功能而言并不重要，诸如此类的话。但是这些更多的是经验法则而不是任何详细的理论。我认为咱们的经验法则显然是错误的。利用这一点，我发现有益突变会存在于人们以为不重要的蛋白质区域。这让人们更加坚定“演化是位好老师”这一观点。基于理论去设计好的酶仍然很困难。

您的发现是否类似于演化计算，即这些程序有时候会开发出来看似并不重要、但如果将其删除代码就无法工作的片段呢？

是的，我认为我们都有一个共同的元素：意外惊喜。两个领域都找到了很难进行逆向工程的解决方案。在蛋白質领域，逆向工程被称为生物化学：人们尝试理解为什么一个序列具有特定的功能以及这个功能是如何演化的。即使我们掌握适应性突变，这件事对于实验室演化而来的酶而言与自然演化而来的酶一样难以做到，我们知道突变是什么，但试图理解它们正在做什么依旧具有挑战，更别提要做预测了。演化计算也存在一些相同的特征。

您是如何将机器学习引进实验室的？

定向演化的强大之处在于它的稳定性，并且对解决许多问题都非常管用，是一款很普适的程序性技术。缺点则是速度慢且令人痛苦。你不得不制造出所有的突变，然后不得不检测所有的突变，因为绝大多数突变并非有益因而还必须得弃用，尔后常常还不得不重复好几轮上述步骤。这些执行起来非常冗长沉闷。

我们梦寐以求的是可以做规模小一些的实验，可能的话，不使用相同的突变范式获得数据，然后将数据与我们对蛋白质的了解结合起来——多序列比对、演化语言模型、结构、分子动力学模拟——并从中学习。我们会使用多模态模型来根据我们在每一轮中学习到的信息来预测下一组应该制作的变异体序列是什么。这就是我们的梦寐以求，也是我们目前正在努力实现的目标。如今，我们死磕这个问题已经好些年了，尝试测试不同的机器学习过程来看哪些过程有优势且在哪种条件下具有优势。不过我们也已经发现了，良好而传统的定向演化是非常棒的基准线，在很多问题面前都难以被撼动。

自20世纪80年代您开始这项工作至今，技术已经发生了如此多的改变，您是否不得不让自己和工序一道基于当今可供使用的技术来进行适应和调整呢？

我热爱工具，作为工程师，我会抓住任何有用的新工具。有许多工具并没有什么用处，所以真正的诀窍在于知道哪些工具能提供更好的信息，创建更好的数据库，等等，然后我会很乐意使用这些工具。举个例子，如今我们可以使用质谱进行中通量筛选，这在过去我们无法做到，现在我们甚至可以使用液相色谱质谱（LCMS）来识别优化后的酶。我们能通过不同的方式制造突变酶库。别人也开发出了非常强大的连续演化工具，这些没有像我在20世纪八九十年代描述的那样普适，但对于特定问题它们更强大。所以被开发出来的不只有工具，还有运用演化来设计的全新模式。

有了定向演化，自上而下式的基于設计构建蛋白质的方法是否还有一席之地呢？

就采用定向演化而言，工作人员总是需要有一个起始点，而这个起始点必须表现出充分的所需功能或与之相近的功能，并且可供测量评估，从而可以对其进行改进。我们常常被卡在找到这个起始点。所以蛋白质设计可能的最大好处之一就是创造一个蹩脚的生物酶，而这个生物酶可以成为定向演化改进的起始点，因此这便有了一个将两种技术完美融合的案例。蛋白质设计还将人带入与自然界全然不同的序列空间，也将人带入不同的功能空间。如今真正的挑战是如何设计拥有我们所需新功能的酶或蛋白质。如果你能做到这一点，你大概就能用这种设计所得的酶来通过定向演化进行改造了。

定向演化是如何帮助减少化工业产生的废弃物呢？

这就是我所研究的主要关注焦点。对我来说，酶及产生酶的微生物的亮点之处在于它们能利用可再生富集资源并将其转化为大量漂亮的化学产物与材料。我们只是浅尝辄止地训练微生物和演化它们所生产的酶来为我们做到这些。化学工艺可以完全被酶法工艺取代，如今已经有一些很好的案例。例如，默克公司因其证明能在制药过程中大幅减少废弃物产生而获得了美国环境保护署（EPA）颁布的绿色化学挑战奖，具体做法便是不再使用有毒重金属，而是采用酶。微生物会为了获取糖分而生产这些绝妙的催化剂，这于未来而言有着美好的前景。

那在您看来，这些酶是否很快就会得到广泛使用呢？

其实，酶已经是一门大生意了。很多酶已经出现在了消费品中。在你的洗衣粉里有各种酶，在各种生产工艺里有各种酶，乙醇产物里或者制造高果糖玉米糖浆过程中有酶和微生物。各种大规模工艺过程都用上了酶。

其实，我们对化学工艺的环境友好性和可持续性要求越高，就越要为产生的废弃物付出代价——于社会而言要为这些废弃物付出真正的代价，因此对于任何使用这些产品的人而言，产生这些废物都应该付出代价——我们越是让生产商将这些代价内化，我们就越会见到酶被采用。人们会自然地向这一点转变。举例来说，这就是为什么默克公司转向生物催化的原因，因为他们不想每生产一公斤药品就产生数百公斤废弃物。处理这些废弃物的代价是高昂的。所以我看到这一改变正在发生。我们身处于转变的初始阶段，但我希望，在接下来的十年或二十年里，我们能见证更多的转变，那些从当前需要靠“坏属性”的化学试剂来完成的工艺转向使用好的酶的转变。

定向演化是否能让酶在极端环境下工作？

能。降解聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料的酶已经演化到十分坚韧，因此能在高温或极限条件下的工业降解过程中工作。纤维素酶的热稳定性也得到了提升，因此能在原料流黏度较低而动力学较高的条件下将纤维素降解为糖。几乎所有的工业案例和工艺都受益于让酶变得更具耐受性，因为这样酶的使用寿命也往往更长，从而降低了成本。

我的意思是，即使是洗衣粉里的酶也得有耐受性，对吧？毕竟谁想在充满了表面活性剂和漂白剂种种的洗衣机里工作呢？这些酶必须得是非常能忍的“小狗皮膏药”。

碳封存也是一个很好的例子。酶工程公司Codexis证实他们能制造一种能在接近100摄氏度作业的碳酸酐酶，并且在这一温度下工艺成效会好得多，而酶的作业环境恶劣到令人惊讶的程度。酶的耐受力比人们想象的还要强得多。当然，它们同时也会非常小，有时候表现得也会很糟糕。

演化后的酶是否会被用于可再生能源生产呢？

2004年，我联合其他人创办了一家名为Gevo的公司，就是通过可再生植物资源生产液体燃料。该公司于2011年上市，目前仍在营业。我们拥有利用玉米和农业废弃物生产异丁醇的技术。然而，石油价格暴跌，玉米价格暴涨，靠这个根本赚不到钱。如果我们不将二氧化碳成本内部化，要与地下开采出的能源竞争十分困难。市面上有很多很棒的技术。可再生乙醇如今被用来制造喷气燃料，并且还有其他许多可能用途。但最重要的是，除非我们真正考虑到从石油中制造这些燃料的环境气候成本，否则生物工艺很难与之竞争。

但我认为将生物学和生物世界里的化学引入我们人类的化学世界，未来是非常光明的，反之亦然！我们可以从化学家所做过的工作中学习，并将其用于教授生物学如何去执行全新的化学任务。所以我们有许多可以相互学习的东西。这是一个全新的领域，对社会发展有巨大的潜力。

您的学术之路并非一步到位，而您也似乎对打破常规毫无保留。在您看来这些偏好是否有助于您在研究中的创新呢？

我认为助我创新的是我愿意尝试各种新事物的意愿。我拥有机械与航空航天工程学士学位和化学工程的博士学位。我必须学习一些生物学知识。我曾旅居世界各地，在读研究生之前做过很多不同类型的工作。我不害怕学习新事物、做新事情，也不害怕以不同于标准的视角看待问题。老实说，如果你要走出去做一些全新的事，你需要具有一定程度的无畏，并且能接受批评，不会在做特立独行之事所带来的负面关注下崩溃。所以我认为，20世纪70年代我所做过的不符合当时对女性定义的标准的事情为后来的我决定在一个当时尚不存在的领域里从事研究提供了优势。

很多人就我的诺贝尔奖获奖之旅发问，好像这样能指明他们自己的道路。要我说，并不存在唯一的道路——你走你自己的路。你必须成为你自己，而不是去模仿其他人。我的意思是，于我自己而言，有趣的道路就是不要与他人相同。好的道路就是拥抱自己的独一无二，去做自己的与众不同。

资料来源 American Scientist