酸笋中微生物区系演替和风味物质形成机制的研究进展

薛冰洁,胡荣,吴良如,杨金来,李彬,张甫生*,郑炯*

1(西南大学 食品科学学院,重庆,400715)2(国家林业和草原局竹子研究开发中心,浙江 杭州,310012) 3(重庆市林业科学院,重庆,400036)

竹笋营养丰富、肉质脆嫩、滋味鲜美,是一种深受广大消费者青睐的森林食品。我国竹笋产量巨大,其中60%用于加工。酸笋是以竹笋为原材料,经无盐或加盐处理,在密封条件下经微生物代谢而成的一种竹笋加工制品。酸笋按照加工技术分为自然发酵和人工发酵,人工发酵因具有发酵周期可控性强、发酵效率高、安全等优点成为目前最常用的发酵方式。经发酵处理的酸笋不仅风味多样,而且口感爽、脆、酸、嫩,微生物资源也更为丰富,产品品质得到显著提高,感官体验也更优[1-2]。

酸笋中含有丰富的乳酸菌资源,包括明串珠菌属、乳杆菌属、乳球菌属和魏斯氏菌属等。微生物的代谢是决定酸笋风味的关键,乳杆菌属、乳球菌属与部分有机酸、低阈值的醛类、酚类以及高阈值的醇类、酯类呈显著正相关,而酸笋的复杂菌群是风味产生的基础条件,两者紧密相连。目前酸笋中微生物演替以及风味物质形成的研究受到越来越多的关注。因此,本文总结了酸笋中微生物群落的构成、变化规律及其影响因素,分类概述了酸笋中的风味物质,从微生物代谢的角度阐释了酸笋中风味物质的形成机理,旨在为酸笋品质的提升提供理论参考。

1 酸笋发酵过程中的主要微生物群落

1.1 酸笋中微生物群落的构成

酸笋中的微生物以细菌为主,主要包括乳杆菌属(Lactobacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳球菌属(Lactococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)等乳酸菌,这些通常也是发酵蔬菜中富集的优势菌群。研究表明,传统发酵酸笋中微生物群落的多样性较高,主要为乳杆菌属、乳球菌属、魏斯氏菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、明串珠菌属等[3],其中部分菌种具有嗜盐、嗜酸的特性。LI等[4]将广西柳州的麻竹笋自然发酵60 d,发现其微生物的多样性显著增加。在门水平上,以蓝菌门、变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门为代表,在属水平上,代表性菌属包括假单胞菌属、乳杆菌属、魏斯氏菌属、肠球菌属,明串珠菌属。在种水平上,主要有植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、醋酸杆菌、瑞士乳杆菌等,而醋酸杆菌、乳酸杆菌是整个发酵阶段的优势菌种。为了解酸笋腌制过程中细菌的动态变化,XIA等[5]在自然发酵的麻竹笋中检测到多株嗜盐菌,红杆菌属、碱杆菌属、盐单胞菌属、食甲基菌属在10%(质量分数)NaCl溶液中正常生长,其中格氏乳球菌、乳酸乳球菌、食窦魏斯氏菌、融合魏斯氏菌在6.5%的NaCl溶液中也可维持正常活性。

酸笋中相关的功能性菌株为短乳杆菌、植物乳杆菌、弯曲乳杆菌、戊糖片球菌和肠系膜明串珠菌亚种等,具有益生、保健、提高食品安全性等作用[6]。研究表明,植物乳杆菌LZ-2-12的胆固醇降解率高达54.27%[7],当植物乳杆菌LC-3-3添加量为6%,pH值为6.0、温度为37 ℃的条件下,亚硝酸盐的降解率为76.58%[8]。部分乳杆菌不仅具有良好的抗氧化[9]、抗炎特性[10],而且还能高效分解木聚糖[11]、高产乳酸和甘露糖[12-13]。

迄今为止,已明确酸笋中的真菌主要为酵母菌,但相关研究鲜少报道。GUAN等[14]首次利用高通量测序研究酸笋中的真菌群落,发现子囊菌门和担子菌门是酸笋中的主要真菌门,其中毕赤酵母属、假丝酵母属、德巴利酵母属、丝孢酵母属、青霉属、哈萨克斯坦属、曲霉属为广东酸笋的主要真菌属,其中赤壁酵母属最为丰富,占比28.32%,其次是含量为13.88%的假丝酵母属,而云南酸笋中主要有赤壁酵母属、接合酵母属、丝孢酵母属、哈萨克斯坦酵母属、青霉属,其中赤壁酵母属为40.62%,其次为19.9%的接合酵母属。

1.2 酸笋发酵过程中微生物群落的演替

酸笋中的发酵微生物在初期变化较大,中后期趋于稳定。肠膜明串珠菌、柠檬明串珠菌等异型发酵乳酸菌在发酵前期占据优势,乳酸、乙酸等有机酸不断积累,异型发酵乳酸菌在发酵后期被植物乳杆菌、乳酸乳球菌等同型发酵乳酸菌代替,最终乳酸菌群落趋于简单化。CHI等[15]发现酸笋发酵初期有酵母菌、丁酸细菌、E-大肠杆菌、霉菌等,在发酵10 d后,发酵液中的乳酸菌出现明显下降,非乳酸菌群体的消失可能是由于乳球菌属、明串珠菌属和魏斯氏菌属产生的抗微生物肽。GUAN等[16]利用MiSeq测序得出厚壁菌门在酸笋发酵初期持续增长,相对丰度最高为98.97%,其中乳杆菌属持续为优势菌种,而乳球菌属、明串珠菌属、肠杆菌属和魏斯氏菌属的丰度在发酵后期普遍降低。也有研究基于PCR-DGGE和Illumina测序技术检测酸笋中群落结构,结果表明1～2 d酸笋中的乳酸菌从105 CFU/g升至109 CFU/g,以魏斯氏菌属、乳球菌属、明串珠菌属为优势菌属。发酵完成时,仅有耐酸乳杆菌和约氏乳杆菌大量存在[17]。

1.3 酸笋中微生物群落的影响因素

发酵方式是影响酸笋微生物群落的重要因素。郑文迪[18]从自然发酵酸笋中挑选耐酸、耐盐,高产乳酸,有效降解亚硝酸的发酵乳杆菌NCU003039为发酵剂进行人工发酵。经对比发现,人工发酵酸笋中微生物的多样性较低,但其安全性更高、品质更优。发酵剂的接种情况也会对酸笋微生物群落产生影响,LU等[19]将传统酸笋中分离的柠檬明串珠菌NM-12和植物乳杆菌L01以不同比例接种到竹笋中,发现混合菌种不仅使酸类、醇类物质含量显著提高,而且还能抑制肠球菌和梭菌,并且植物乳杆菌的含量随发酵剂的增加而升高。

食盐是酸笋咸味的主要来源,同时也是影响其微生物代谢的重要因素之一[20]。研究表明,在高盐浓度下魏斯氏菌和乳酸杆菌的活性较高,但在低盐浓度下明串珠菌的活性较高[21],并且在2.5%和3.5%盐浓度下含有较高数量的酵母菌[22]。也有研究得出食窦魏斯氏菌、乳球菌属、魏斯氏菌属、乳酸乳球菌为低盐腌制笋的主要发酵菌,而高盐腌制笋中主要为趋向于耐盐、耐酸性的绿色气球菌、芽孢杆菌属[23]。

2 酸笋中的风味物质

2.1 有机酸

酸笋中的有机酸来源于原料和微生物的发酵作用。在发酵前期,通过丙酮酸的还原反应生成大量的乳酸、乙酸[24],发酵后期,各类有机酸发挥协同作用构成酸笋的酸味。BADWAIK等[25]在鲜笋中检测到草酸、酒石酸、甲酸、丙酮酸和乳酸,而发酵酸笋中检测不到草酸和丙酮酸,但乳酸、酒石酸从初期2.824 mg/g、1.733 mg/g最高增至39.492 mg/g、51.021 mg/g。酸笋中的有机酸受到发酵方式的影响。ZHENG等[26]采用顶空固相微萃取法检测到自然发酵酸笋中的有机酸占风味物质总量的11.5%,其中乙酸已占6.08%,又利用气相色谱-嗅闻联用技术鉴定出丁酸和己酸为主要的有机酸。LU等[19]发现植物乳杆菌与乳酸呈高度正相关,而柠檬明串珠菌与乙酸呈高度的正相关。

2.2 呈味氨基酸

呈味氨基酸主要源自酸笋发酵微生物对原料中蛋白质、肽的代谢作用,大部分氨基酸呈酸味、甜味和鲜味,小部分氨基酸呈苦味。发酵前期,竹笋的内源酶与微生物共同作用产生游离氨基酸[27]。发酵后期,氨基酸作为微生物的营养物质、风味物质的前体物质而被消耗。武源等[28]采用在酸笋中测定到16种游离氨基酸,其中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等必需氨基酸含量较高。ZHENG等[29]发现酸笋中17种氨基酸的滋味活性值均小于1,但它们可转化为酚类、醛类从而影响酸笋的滋味。WANG等[6]发现酸笋经发酵后,呈味氨基酸含量显著增加,谷氨酸为含量最高的游离氨基酸,但未检测到半胱氨酸和精氨酸。

2.3 挥发性风味物质

酸笋中的挥发性风味物质主要包括酚类、醛类、醇类、酯类以及其他的酮类、呋喃类等,是赋予酸笋独特风味的主要途径。目前从酸笋中已鉴定出的主要风味物质如表1所示,酸笋中的酚类、醛类含量较高且普遍阈值较低,主要在发酵前期积累,呈现先升高后降低的趋势,是酸笋异味的主要来源,其中酚类主要源自酪氨酸的转氨、脱羧作用,醛类来自streker降解、酵母菌的发酵作用以及支链氨基酸的转氨、脱羧作用。醇类、酯类则普遍阈值较高,主要在发酵中后期积累,赋予酸笋花果香及清香味,其中醇类源自原料和乳酸菌的发酵作用,呈现先减少后增加的变化趋势,而酯类由酯化反应和醇解作用产生,在发酵过程中含量不断降低。总的来说,大部分风味物质与乳酸菌属、乳杆菌属、明串珠菌属等呈正相关,与不动杆菌属、肠杆菌属等呈负相关。

表1 酸笋中的主要挥发性风味物质Table 1 The main volatile flavor compounds in Suansun

此外,发酵方式、发酵剂的种类和比例也会影响酸笋中的挥发性风味物质,并且采用不同测定方法,风味物质的检测结果也不同。研究发现人工发酵酸笋中的酯类含量高于自然发酵,其中乙酸甲酯的含量最高,而醛类含量低于自然发酵,酚类、酮类、酸类则较为接近[30]。郭荣灿等[31]比较研究了广西发酵酸笋风味物质的不同提取方法,发现液液萃取法和蒸馏萃取法的萃取物质种类分别为34种和24种,而顶空固相微萃取法的萃取物质种类为41种。

3 微生物诱导酸笋风味形成机制

微生物体系的代谢是产生风味物质的主要途径,通过基因测序的结果构建出酸笋主要风味物质的代谢网络图如图1所示。由图1可知,碳水化合物代谢、氨基酸代谢是酸笋中微生物的2条主要代谢途径,其中糖酵解、磷酸戊糖途径、莽草酸途径以及三羧酸循环是醛类、酚类和各类氨基酸的主要来源,并且各氨基酸之间,酸、醛、酯之间也可相互转化。

图1 酸笋主要特征风味物质形成的代谢网络图[38]

3.1 碳水化合物代谢

竹笋中的葡萄糖、蔗糖、果糖是酸笋中微生物代谢的主要能量来源[39],糖酵解、糖异生途径,丙酮酸代谢以及葡萄糖和蔗糖降解是最为活跃的3条代谢途径。关倩倩[38]分析了酸笋宏基因组KEGG代谢通路,发现乳杆菌属、魏斯氏菌属、肠杆菌属、明串珠菌属、乳球菌属、克雷伯氏菌属通过蔗糖磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统、β-呋喃果糖苷酶等酶将蔗糖分解为葡萄糖。降解而来的单糖与竹笋原料中的葡萄糖成为糖酵解途径和磷酸戊糖途径直接能量来源,其中糖酵解对酸笋风味的形成至关重要。发酵前期,乳酸菌将葡萄糖转化为丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸等中间代谢产物。随后,逐渐丰富的乳酸菌参与到糖酵解、丙酮酸代谢等途径中,其中乳球菌属、乳杆菌属等同型发酵乳酸菌经糖酵解途径将葡萄糖转化为乳酸,而魏斯氏菌属、明串珠菌属等异型发酵乳酸菌则通过戊糖磷酸途径将葡萄糖转化为乳酸、乙酸、乙醇和CO2等代谢产物。此外,乳酸菌还能进一步将有机酸转化为酯类、酮类、醛类等其他挥发性风味物质。

3.2 蛋白质和氨基酸代谢

乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属和肠杆菌属等具有蛋白质水解活性,可将竹笋中的蛋白质水解为肽和氨基酸,氨基酸也可由糖酵解、三羧酸循环的中间产物或有机酸作为前体物质合成。氨基酸又可进一步通过转氨、脱羧、裂解等转化为醛类、醇类等风味物质。SONAR等[40]测定了从传统发酵酸笋中分离的植物乳杆菌、短乳杆菌、弯曲乳杆菌、木糖乳杆菌等的蛋白质水解性能及蛋白酶活性,发现它们在脱脂乳琼脂平板上均有清晰的酪蛋白水解区,其中木糖乳杆菌的蛋白酶活性高达64.2 nmol/mL。刘艳婷等[41]发现毛竹笋发酵后蛋白质含量从2.2 g/100 g降低到0.89 g/100 g,表明蛋白质在发酵过程中发生了降解,这也是生成风味物质的一条重要途径。有研究报道缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等支链氨基酸在转氨酶作用下生成α-酮酸,之后经α-酮酸脱羧酶作用转化为3-甲基丁醛、2-甲基丁醛等醛类物质及对应的醇类物质,与之相关的微生物有乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属,其中乳球菌属也对芳香族氨基酸表现出较高的活性[42]。

4 小结与展望

酸笋中以乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属等为代表的微生物在不同阶段发生的演替决定着酸笋生产过程中的风味形成,而风味又是评价酸笋品质的关键。因此,研究酸笋中微生物和风味物质及两者的相关性逐渐成为酸笋研究的热点,未来可针对以下几方面展开探索：a)从传统发酵酸笋中分离出发酵性能优良的菌株制备直投式的酸笋专用复合发酵剂,提高发酵效率,从而用于酸笋的工业化和标准化生产。b)目前酸笋中各类微生物的代谢通路并不明晰,随着分子生物学技术的发展,利用宏基因组学、宏转录组学、蛋白质组学等解析不同微生物的完整代谢途径及微生物的互作效应,揭示主要微生物的特定功效及其对不同风味物质形成的影响机制。c)对特征性风味物质形成具有较大影响的代谢微生物进行基因改造,通过调节其产酶的类型及酶活力来定向调节特征性风味物质的含量,从而实现酸笋风味品质的定向调控。

酸笋作为一种传统发酵蔬菜制品,其风味独特、口感丰富,被称作螺蛳粉的灵魂配料,深受人们的喜爱。以乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属、肠杆菌属等为主的乳酸菌通过代谢产生有机酸、氨基酸以及丰富的挥发性风味物质,赋予酸笋独特的风味。因此,通过对酸笋中微生物演替和风味物质形成机制的系统研究,将为高品质酸笋的标准化和工业化提供有益依据。