虚拟筛选荭草素和异荭草素降血糖靶点和体外活性评价

赵晨颖 ，韩雪 ，贺一凡 ，史海龙，王斌，卫昊，史永恒*，刘继平

1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046

2.陕西省中医药管理局 中药药效机制与物质基础重点研究室，陕西 咸阳 712046

糖尿病是以机体对糖利用效率降低引起的血糖过高为主要特征的代谢性疾病，进而引起蛋白质和脂肪代谢异常，后期会逐渐导致眼、心、脑、肾、足等多器官急慢性并发症。2015—2017 年我国18岁及以上人群糖尿患病率为11.2%，达1.56 亿人[1]。因此，寻找治疗糖尿病的药物是药物研究的热点。

荭草素和异荭草素是一类黄酮碳苷类化合物，为蓼科植物荭蓼PolygonumorientaleL.的主要活性成分，在西番莲、决明、黄荆、竹叶、满天星、麻花艽等中药材中也存在。近年来的药理学研究表明，荭草具有丰富的药理活性，其主要活性成分荭草素和异荭草素具有心血管保护、抗衰老、抗肿瘤、抗炎、调血糖等药理作用[2-4]。荭草素和异荭草素可以改善脂肪细胞中的葡萄糖代谢，维持肝细胞的底物利用率来改善胰岛素抵抗现象已被证实[5]，但关于其降血糖的靶点及体外活性研究较少。

本研究拟通过虚拟分子对接筛选中药荭草中黄酮碳苷类有效成分荭草素和异荭草素可能的降血糖靶点，并对关键靶点进行体外活性测试，从而揭示荭草素和异荭草素降血糖作用及其作用机制。

1 材料

1.1 药品及主要试剂

荭草素（成都曼思特化学制剂有限公司，质量分数≥98%，批号20171105）；异荭草素（成都曼思特化学制剂有限公司，质量分数≥98%，批号20171105）；荧光脱氧葡萄糖（1-NBDG，药明康德新药开发有限公司，批号ET4099-7-P1）；达格列净（上海瀚香生物科技有限公司，批号2014102202）；4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷（PNPG，成都华娜化学制剂有限公司，批号20171026）；阿卡波糖（成都艾娜华化学制剂有限公司，批号20170828）；DMEM培养基（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号GP21110161645）；胰蛋白酶（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号CR2112015）；磷酸缓冲液（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号WH0022A071）；氯化胆碱、氯化钾、氯化镁、氯化钙（天津市天力化学试剂有限公司）。

1.2 细胞

稳定过表达钠–葡萄糖协同转运蛋白 2（SGLT2）的HEK293（人胚胎肾上皮细胞），稳定高表达蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）的293T 细胞（人胚肾细胞），由中国医学科学院协和细胞中心提供。

1.3 仪器

Radiance 2100 CLSM 激光共聚焦扫描显微镜（Bio-Rad 公司），MCO-15AC CO2培养箱（Sanyo 公司），Enspire 荧光酶标仪（Perkinelmer 公司）。

2 实验方法

2.1 分子对接

从www.rcsb.org 网站依次下载糖尿病相关靶点在 Schrödinger 软件中对受体结构用 Protein Preparation Wizard 模块分别进行加氢、加电荷、去除结晶水等处理，并采用Glide 模以原配体为中心（GPR40 和SGLT2 以文献报道活性位点残基为中心）生成格点文件；采用LigPrep 模块对配体进行处理，采用Epik 方法生成pH（7±2）的所有可能构象，采用Glide 模块以标准精度进行分子对接，得出分子对接结果，并计算阳性对照物与荭草素/异荭草素的分子对接得分差异度。

得分差异度＝（阳性对照物得分－荭草素/异荭草素对接得分）/阳性对照物得分

2.2 体外抑制SGLT2 活性实验

本研究采用稳定过表达SGLT2 的人胚肾细胞（HEK293）模型，并以1-NBDG 为底物进行葡萄糖转运实验，采用文献报道[6]的方法初步评价化合物对HEK293 细胞SGLT2 摄取功能的抑制强度。

将浓度为3×108个/L 的过表达SGLT2 的HEK293 细胞按100 μL/孔细胞铺板，90%融合后，采用低糖无血清DMEM 培养基处理2 h 后，用非特异性摄取缓冲液（Na+-free buffer）/Na+依赖性摄取缓冲液（Na+-buffer）清洗1 遍，再加入含有1-NBDG（100 μmol/L）的摄取液进行葡萄糖摄取。

在上述培养板中按50 μL/孔依次加入荭草素、异荭草素和达格列净（3 个平行浓度）溶液，浓度均为1×10−5mol/L，在37 ℃下摄取4 h；然后加入含有0.5 mmol/L 根皮苷的摄取缓冲液使反应停止；在荧光显微镜下观察细胞内荧光强度。将0.1 mol/L NaOH 裂解细胞转移至底部透明的96 孔黑板中，采用荧光酶标仪检测细胞内1-NBDG 含量（激发波长/发射波长：485 nm/535 nm）。采用荧光酶标仪检测细胞裂解液的荧光强度，结果以荧光强度/蛋白含量来表示。

2.3 体外抑制α-葡萄糖苷酶活性实验

采用文献报道的方法[7-8]评价荭草素和异荭草素对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。实验将分为对照组、荭草素（100 μmol/L）组、异荭草素（100 μmol/L）组、阿卡波糖（100 μmol/L）组，在160 μL 的96 孔板开展，每组3 个平行孔。将20 μL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.0）、20 μL 底物溶液（2.5 mmol/L pNPG溶于0.1 mol/L 磷酸缓冲液）和20 μL 100 μmol/L 待测药物依次加入孔中，混匀，在37 ℃水浴中振荡10 min 后，再加入20 μL α-葡萄糖苷酶溶液（在含有0.2% BSA 的0.01 mol/L 磷酸缓冲液中加入0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶，溶解），充分混匀，然后放入37 ℃水浴中反应20 min。结束后加入80 μL 0.2 mol/L 碳酸钠溶液中止反应，采用酶标仪在405 nm处测定其吸光度（A），最后根据公式计算出各样品的抑制率。

抑制率＝1－（A受试－A空白）/（A对照－A空白）

2.4 体外抑制PTP1B 活性实验

采用文献报道的方法[9]测定荭草素和异荭草素对PTP1B 的抑制活性。本实验分为对照组、荭草素（100 μmol/L）组、异荭草素（100 μmol/L）组、阳性对照化合物V[10]（100 μmol/L）组，PTP1B 酶稀释至0.5 ng/μL 待用，以pNPP 作为PTP1B 的底物，每组3 个平行孔。在160 μL 的96 孔板中，将10 μL待测物与5 μL PTP1B 于室温下共孵5 min，后依次加入35 μL 反应液（含有50 mmol/L HEPES、5 mmol/L DTT、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA）和50 μL pNPP 溶液（2 mmol/L，pH 7.0），在30 ℃下孵育10 min，加入25 μL 3 mol/L 氢氧化钠溶液终止酶反应。水解产物对硝基苯酚钠在405 nm 处有很强的光吸收，采用酶标仪测定405 nm 处的A，根据公式计算出各样品的抑制率。

抑制率＝1－（A受试－A空白）/（A对照－A空白）

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 荭草素和异荭草素与糖尿病相关靶点的分子对接结果

从www.rcsb.org 网站下载糖尿病相关靶点的晶体结构，见表1。荭草素和阳性对照物与糖尿病靶点的分子对接结果以结合能表示见表2，其中SGLT2、α-葡萄糖苷酶与阳性对照物达格列净和阿卡波糖的分子对接结果分别−9.79 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）、−5.58 kcal/mol；而荭草素与SGLT2 和α-葡萄糖苷酶对接得分分别为−9.32 kcal/mol、−5.67 kcal/mol，其与阳性对照物得分差异度分别为4.80%、1.59%，分子对接结果差异度小。其中荭草素与SGLT2 中的Thr153、Trq291、Ser460 形成4 个氢键，与α-葡萄糖苷酶中的Asp282、Asp518、Arg600、Asp616 形成6 个氢键。

表1 糖尿病相关靶点及PDB 编号Table 1 Diabetes-related targets and PDB numbers

表2 荭草素与糖尿病靶点的分子对接结果Table 2 Molecular docking results of orientin and diabetes target

异荭草素和阳性对照物与糖尿病靶点的分子对接结果见表3，异荭草素与SGLT2 中的Asn75、Aer460、Ser400 形成 4 个氢键，对接结果为−8.63kcal/mol，其与阳性对照物达格列净对接得分相比其差异度为11.84%；与α-葡萄糖苷酶中的Asp282、Arg281、Asp404、Phe525、Asp616 形成5个氢键，对接结果为−5.34 kcal/mol，比阳性对照药阿卡波糖的−5.58 kcal/mol 略弱，但二者的差异度为仅4.30%。异荭草素与其他靶点的分子对接普遍较弱，而与PTP1B 的分子对接结果仅为−4.93 kcal/mol，其与阳性对照物化合物902 的差异度达46.88%。

表3 异荭草素与糖尿病靶点的分子对接结果Table 3 Molecular docking results of isoorientin and diabetes target

由表2、3 可知，荭草素和异荭草素在糖尿病靶标中，对α-葡萄糖苷酶有较强的结合作用，其次对SGLT2 也具有较好的结合能力，但对PTP1B 的结合能力很弱。因此。荭草素和异荭草素的降血糖作用可能是通过抑制双靶点α-葡萄糖苷酶和SGLT2 发挥。

3.2 荭草素和异荭草素抑制 α-葡萄糖苷酶、SGLT2、PTP1B 活性

体外活性测试结果表明，在100 μmol/L 时荭草素对α-葡萄糖苷酶的抑制率为（16.7±5.8）%，异荭草素对α-葡萄糖苷酶的抑制率为（11.8±3.8）%，同浓度的阳性对照药阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率为（63.7±5.8）%；荭草素对SGLT2 蛋白的抑制率为（15.4±1.2）%，异荭草素对SGLT2 抑制率为（9.4±1.1）%，而同浓度的阳性对照药达格列净对SGLT2 的抑制率为（92.7±8.8）%；荭草素对PTP1B的抑制率仅为（3.0±0.5）%，异荭草素对PTP1B 的抑制率为（−3.8±0.6）%，同浓度的阳性对照药V 对PTP1B 的抑制率为（73.4±8.3）%，见表4。

表4 荭草素、异荭草素对SGLT2、α-glucosidase、PTP1B 蛋白的抑制率的影响Table 4 Effects of orientin and isoorientin on the inhibition rates of SGLT2,α-glucosidase and PTP1B proteins

4 讨论

糖尿病的药物治疗靶点多，药物多，但糖尿病发病率高，严重影响人们的身心健康和生活质量，且许多治疗糖尿病的药品商品化严重，成本高，且药物之间的相互作用与不良反应较多[13]，而传统中药在治疗糖尿病时可能耐受性较强，不良反应较少，因此从天然药物中寻求治疗糖尿病的药物研究一直是药学研究的热点。SGLT2 抑制剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂均是良好的降血糖药物[14-16]，但是兼有抑制SGLT2 和α-葡萄糖苷酶的药物报道较少。

在靶点筛选中发现，荭草素和异荭草素对α-葡萄糖苷酶具有较好的结合作用，其分子对接得分与阳性对照药阿卡波糖基本接近，但其细胞实验发现荭草素和异荭草素在100 μmol/L 时对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为（16.7±5.8）%、（11.8±3.8）%，均对α-葡萄糖苷酶表现出温和的抑制作用；荭草素和异荭草素对SGLT2 也表现出较好的结合作用，其分子对接得分与阳性对照药达格列净的差异度分别为4.80%、11.84%，但细胞实验显示二者对SGLT2的抑制率分别为（15.4±1.2）%、（9.4±1.1）%，均有一定的抑制活性；在PTP1B 的研究中，荭草素和异荭草素在分子对接均表现出对该蛋白弱的结合作用，在细胞实验中几乎无抑制作用。因此，荭草素和异荭草素可同时抑制α-葡萄糖苷酶和SGLT2 2个蛋白，呈现出很好的双靶点降血糖作用，是潜在的一类具有SGLT2 和α-葡萄糖苷酶双靶点抑制的化合物。

对比荭草素和异荭草素，可以发现，荭草素对α-葡萄糖苷酶和SGLT2 2 个蛋白表现出较强的抑制作用。在分子对接中，荭草素与阿卡波糖的分子对接差异度为1.59%，优于异荭草素与阿卡波糖分子对接差异度4.30%，荭草素与达格列净的分子对接差异度为4.80%，也优于异荭草素与达格列净分子对接差异度11.84%；在细胞实验中，荭草素在100 μmol/L 时对α-葡萄糖苷酶SGLT2 蛋白的抑制率分别为（16.7±5.8）%、（15.4±1.2）%，均优于异荭草素对α-葡萄糖苷酶SGLT2 蛋白抑制活性的（11.8±3.8）%、（9.4±1.1）%。因此，荭草素比异荭草素具有更好的靶点抑制活性，可能比异荭草素具有更好的降血糖作用。

综上，荭草素和异荭草素对SGLT2 和α-糖苷酶均具有一定的抑制活性，对PTP1B 基本没有抑制作用，且荭草素的体外活性略强于异荭草素。荭草素有可能作为一类具有双靶点作用的降血糖先导化合物，对其开展进一步研究，拓展荭草素在降血糖方面的应用，对新型降血糖药物的研发具有一定意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突