黄芩苷通过PDGF/P38 MAPK 信号通路对肺动脉高压大鼠的保护作用

张晶晶， 王洪新*

锦州医科大学心血管药物重点实验室，辽宁 锦州 121001

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）被定义为静息状态平均肺动脉压（mean pulmonary artery pressure，mPAP）≥25 mmHg[1]。肺部炎症、氧化应激和凋亡等发生，使得肺动脉压力异常增高，进而出现细胞增殖和病理性肺血管重构。P38 MAPK 作为重要的炎症分子，其磷酸化后可加速细胞凋亡发生，在PH发展中发挥重要作用[2]。研究表明，与健康成年人相比，PH 患者肺组织中血小板源生长因子（plateletderived growth factor，PDGF）水平显著升高；PDGF 可促进平滑肌细胞增殖、迁移，进而加速PH 进程[3]；PDGF 通过激活P38 MAPK 途径诱导上皮-间质转化发生[4]。黄芩苷（Baicalin）作为黄芩的主要活性成分之一，具有抗动脉粥样硬化、保护心肌细胞和内皮细胞、抑制心肌重塑等药理作用[5]。黄芩苷可逆转野百合碱（monocrotaline，MCT）诱导的肺动脉高压大鼠的肺动脉重构，并抑制肺动脉中膜平滑肌细胞增殖[6]，黄芩苷还可通过增强A2AR 活性下调PI3K/AKT 信号对临床PH 具有保护作用[7]。但黄芩苷对肺动脉高压的保护作用机制尚不明确。本研究以PDGF/P38 MAPK 信号通路为作用靶点探讨黄芩苷对PH 的保护作用和具体机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 黄芩苷购自南京景竹生物科技有限公司（货号：21967-41-9），抗体bax，bcl-2 购自爱博克生物科技公司（货号：A19684，A11025），二氢乙锭染色液购自碧云天生物科技公司（货号：S0063），总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒购自南京建成生物技术有限公司（货号分别为：A001-3-2、A003-1-2），β-actin 抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司（货号：66009）。

1.1.2 实验动物 健康雄性SD 大鼠40 只，体质量（200±10）g，由锦州医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（辽）2014-0004。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 将40 只健康雄性SD 大鼠随机分为4 组：空白对照组（Control group）、模型组（Model group）、黄芩苷50 mg/kg 组（baicalin low-dose group）和黄芩苷100 mg/kg 组（baicalin high-dose group）。通过单次腹腔注射MCT（60 mg/kg）建立肺动脉高压模型。黄芩苷用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）助溶，连续灌胃28 d，对照组0.5% CMC-Na 灌胃28 d。

1.2.2 右心导管法 通过对大鼠右颈静脉插管，采用多导生理记录仪进行数据采集，测定右心室收缩压（right ventricular systolic pressure，RVSP）和肺动脉平均压（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）。将左心室壁（left ventricle，LV）、室间隔（spetum，S）和右心室壁（right ventricle，RV）称重，RV/（LV+S）即为右心肥厚指数（RVIH）。取左肺上叶用滤纸吸干水称重，为湿重（wet weight，W），放入烘箱80 °C 烘干72 h 称重，为干重（dry weight，D），W/D 即为肺干湿重比。

1.2.3 ELISA 法 按照ELISA 试剂盒说明书，测定大鼠血清中总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、GSH-px、细胞间粘附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、IL-8 和IL-1β 含量。

1.2.4 DHE 染色法 根据DHE 试剂盒说明，检测大鼠肺组织肺组织活性氧（reactive oxygen species，ROS）的形成情况。

1.2.5 免疫荧光法 4%多聚甲醛固定肺组织，经石蜡包埋和切片后，进行高压抗原修复，0.5% Triton 浸泡20 min，5% BSA 封闭30 min。予以bax（1：500）和bcl-2（1：100）4 ℃孵育过夜，过夜后滴加相应荧光二抗，在荧光倒置显微镜下观察（避光），通过Image-Pro Plus 软件计算，平均荧光强度（mean density）=光密度总和（integrated optical density，IOD）/面积总和（area of interest，AOI）。

1.2.6 免疫蛋白印迹法 用裂解缓冲液（RIPA+1%PMSF）提取大鼠肺组织的蛋白。蛋白浓度用BCA蛋白检测试剂盒进行测定。将样品用10%～12%聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）分离，转移至PVDF 膜上，用1% BSA 封闭1.5 h，然后与抗体P38 MAPK，PDGF 和β-肌动蛋白在4 ℃过夜孵育。用TBST 洗涤膜3 次，室温下二抗孵育2 h，结果用Image-J 软件进行分析。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 黄芩苷对PH 大鼠血流动力学改善情况

与空白对照组比较，模型组大鼠mPAP、RVSP、RVHI 和W/D 显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，黄芩苷（50 mg/kg 和100 mg/kg）大鼠mPAP、RVSP、RVHI和W/D 显著降低（P＜0.01）（表1）。表明黄芩苷能够改善PH 大鼠血流动力学情况以及降低干湿重比值。

表1 黄芩苷对PH 大鼠血流动力学影响（±s，n=6）Tab.1 Effect of baicalin on hemodynamics in rats with PH (Mean±SD, n=6)

表1 黄芩苷对PH 大鼠血流动力学影响（±s，n=6）Tab.1 Effect of baicalin on hemodynamics in rats with PH (Mean±SD, n=6)

注：##P＜0.01，与空白对照组比较** P＜0.01，与模型组比较Note: Compared with Control group, ##P＜0.01; Compared with Model group，**P＜0.01）.

W/D分组Group mPAP（mmHg）RVSP（mmHg）RVHI 3.32±0.23 5.72±0.41##4.37±0.32**4.15±0.17**空白对照组Control group模型组Model group黄芩苷（50 mg/kg）Baicalin low-dose group黄芩苷（100 mg/kg）Baicalin high-dose group 20.33±0.43 40.23±2.48##33.30±2.91**30.27±1.51**21.31±0.31 42.51±3.22##32.31±2.60**29.21±1.43**0.16±0.21 0.58±0.01##0.43±0.03**0.37±0.13**

2.2 黄芩苷减轻PH 大鼠炎症反应

与空白对照组比较，模型组大鼠血清中IL-18、IL-1β、ICAM-1 和VCAM-1 炎症因子表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，黄芩苷（50 mg/kg 和100 mg/kg）大鼠血清中IL-18、IL-1β、ICAM-1 和VCAM-1炎症因子表达水平降低（P＜0.01）（表2）。表明黄芩苷能够减轻PH 大鼠炎症反应。

表2 黄芩苷对PH 大鼠血情中炎症因子影响（±s，n=8）Tab.2 Effects of baicalin on serum inflammatory factors in rats with PH (Mean±SD, n=8)

表2 黄芩苷对PH 大鼠血情中炎症因子影响（±s，n=8）Tab.2 Effects of baicalin on serum inflammatory factors in rats with PH (Mean±SD, n=8)

注：##P＜0.01，与空白对照组比较**P＜0.01，与模型组比较Note: Compared with Control group, ##P＜0.01; Compared with Model group, **P＜0.01.

VCAM-1(ng/mL)200.12±0.17 300.21±0.21##260.21±1.29**251.03±0.31**分组Group空白对照组Control group模型组Model group黄芩苷（50 mg/kg）Baicalin low-dose group黄芩苷（100 mg/kg）Baicalin high-dose group IL-18(pg/mL)10.21±0.21 17.25±0.35##13.21±0.28**12.01±0.21**IL-1β(pg/mL)20.21±0.18 37.11±0.19##32.29±0.29**31.09±0.27**ICAM-1(pg/mL)22.89±0.21 30.91±0.12##24.03±0.39**23.93±0.18**

2.3 黄芩苷抑制PH 大鼠氧化应激

与空白对照组比较，模型组大鼠肺组织中ROS水平显著升高（P＜0.01），血清中SOD 和GSH-px 表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，黄芩苷（50 mg/kg 和100 mg/kg）大 鼠ROS 水 平 显 著 降 低（P＜0.01），血清中SOD 和GSH-px 表达水平显著升高（P＜0.01）（图1）。说明黄芩苷能够抑制PH 大鼠氧化应激。

图1 黄芩苷对PH 大鼠氧化应激影响（±s，n=6）A：各组大鼠肺组织ROS 形成情况B：各组大鼠肺组织ROS 统计学情况C：各组大鼠血清中SOD 含量D：各组大鼠血清中GSH-px 含量##P＜0.01，与空白对照组比较**P＜0.01，与模型组比较Fig.1 Effect of baicalin on oxidative stress in rats with PH (Mean±SD, n=6). A: ROS levels in lung tissues of rats in each group; B:ROS statistical results in lung tissues of rats in each group; C: SOD content in serum of rats in each group; D:GSH-px content in serum of rats in each group. Compared with Control group, ##P＜0.01; Compared with Model group, **P＜0.01.

2.4 黄芩苷对PH 大鼠内皮细胞凋亡影响

与空白对照组比较，模型组大鼠肺组织中bax 阳性细胞显著增多，bcl-2 阳性细胞显著减少，且bax/bcl-2 显著增大；与模型组比较，黄芩苷（50 mg/kg 和100 mg/kg）大鼠肺组织中bax 阳性细胞显著减少，bcl-2 阳性细胞显著增多，且bax/bcl-2 显著降低（图2）。说明黄芩苷能够抑制PH 大鼠肺组织内皮细胞凋亡。

图2 黄芩苷对PH 大鼠内皮细胞凋亡影响（±s，n=6）A：各组大鼠肺组织bax 免疫荧光染色B：各组大鼠肺组织bcl-2 免疫荧光染色C：bax 统计学情况D：bcl-2 统计学情况E：bax/bcl-2 统计学情况##P＜0.01，与空白对照组比较** P＜0.01，与模型组比较Fig.2 Effect of baicalin on apoptosis of endothelial cells in rats with PH (Mean±SD, n=6). A: Immunofluorescence staining of bax in lung tissues of rats in each group; B: Immunofluorescence staining of bcl-2 in lung tissues of rats in each group; C: Statistical result of bax; D: Statistical result of bcl-2; E: Statistical result of bax/bcl-2; Compared with Control group, ##P＜0.01; Compared with Model group, **P＜0.01.

2.5 黄芩苷通过PDGF/P38 MAPK信号通路发挥作用

与空白对照组比较，模型组大鼠肺组织中PDGF和P38 MAPK 蛋白含量显著降低，与模型组比较，黄芩苷（50 mg/kg 和100 mg/kg）大鼠肺组织中PDGF 和P38 MAPK 蛋白含量显著升高（图3）。表明黄芩苷可能通过PDGF/P38 MAPK 信号通路为靶点发挥作用。

图3 黄芩苷对PDGF/P38 MAPK 信号通路影响（±s , n=3）A：免疫蛋白印迹检测PDGF 和P38 MAPK 蛋白表达代表图 B：各组大鼠肺组织P38 MAPK 相对表达量 C：各组大鼠肺组织PDGF 相对表达量 ##P＜0.01，与空白对照组比较** P＜0.01，与模型组比较Fig.3 Effects of baicalin on PDGF/P38 MAPK signaling pathway（Mean±SD, n=3）. A: Western blot detection of PDGF/P38 MAPK protein expression; B: The relative expression of P38 MAPK in lung tissue of rats in each group; C: The relative expression of PDGF in lung tissue of rats in each group; Compared with Control group, ##P＜0.01; Compared with Model group, **P＜0.01.

3 讨论

肺动脉高压（PH）是一种影响肺动脉和静脉循环以及右心室功能的疾病[8]。本实验通过单次腹腔注射MCT 建立大鼠肺动脉高压模型，表明MCT 可选择性地损伤内皮细胞诱导肺动脉高压形成。PH 发生时，出现肺部炎症、氧化应激和凋亡等，使得肺动脉压力异常增高，进而出现细胞增殖和病理性肺血管重构。某些细胞因子和趋化因子，包括白介素IL-1β，IL-6，IL-8 和单核细胞趋化蛋白，其循环水平在PH 患者中异常升高[9]。另有研究表明，血清中细胞间粘附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）水平升高可能是系统性硬化症合并肺动脉高压的标志[10]。大量实验表明，在肺动脉高压发展过程中，机体氧化系统（ROS）与抗氧化系统（SOD 和GSH-px）的失衡，使得内皮细胞激活，致氧化应激发生，并加重内皮功能障碍、凋亡和平滑肌细胞增殖，进而使肺血管持续收缩，加重肺动脉压力升高[11]。本实验表明：黄芩苷给药组大鼠中，mPAP、RVSP、RVHI 和W/D 显著降低，说明黄芩苷能够改善PH 大鼠血流动力学情况且降低肺干湿重比值；血清中IL-18、IL-1β、ICAM-1 和VCAM-1 炎症因子水平显著降低，说明黄芩苷能够减轻PH 大鼠炎症反应；肺组织中ROS 水平显著降低，血清中SOD 和GSH-px 表达水平显著升高，说明黄芩苷能够改善PH 大鼠氧化应激；肺组织中bax 阳性细胞显著减少，bcl-2 阳性细胞显著增多，且bax/bcl-2 显著降低，说明黄芩苷能够抑制PH 大鼠内皮细胞凋亡。因此黄芩苷对野百合碱诱导的肺动脉高压具有保护作用。

P38 MAPK 信号通路是MAPK 通路的重要分支，其作为重要的炎症分子，磷酸化后可加速细胞增值、凋亡的发生，在PH 发展中发挥重要作用[12]。在PH 患者重塑的肺小动脉中表现出βPDGF 受体（βPDGFR）表达增强和磷酸化，PDGF 能够诱导PH 中肺血管重构[13]。PDGF 还可促进平滑肌细胞增殖、迁移，进而加速PH 进程[14]。研究表明：辣椒素预处理能够减轻P38 MAPK 途径介导的PH 大鼠炎症反应，逆转PH 发展[15]。PDGF 通过激活P38 MAPK 途径诱导上皮-间质转化发生[4]。因此推测黄芩苷可能通过PDGF/P38 MAPK 信号通路为保护PH 的作用靶点。结果表明，黄芩苷治疗后，野百合碱诱导的PH 大鼠肺组织中PDGF 和P38 MAPK 的蛋白含量显著减少。进一步说明，黄芩苷可通过PDGF/P38 MAPK 信号通路对肺动脉高压大鼠起保护作用。