椴叶鼠尾草抗烟草花叶病毒活性成分研究

王子夫, 闫俊伊, 刘 洋, 吴江梅, 闫晓慧, 胡世俊

(1. 西南林业大学生物多样性保护学院云南省森林灾害预警与控制重点实验室, 昆明 650224;2. 西南林业大学林学院, 昆明 650224)

病毒作为危害植物安全的病原之一,严重程度仅次于真菌,其中,烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)是一种被研究较为深入的典型病毒[1],危害大、防治难[2],病毒粒子稳定,可侵染500种以上植物[3],对作物的栽培生产造成了严重的经济损失。在我国大多数烟区中,烟草花叶病流行年份的田间发病率达50%以上[4],植株任意部位只要被TMV侵染,病毒就会在活体细胞内进行蛋白质外壳和核酸的复制,致使全株植物携带病毒[5]。TMV为单链RNA病毒,是发现最早的植物病毒,常用于抗病毒药物的筛选和活性评价,是发现先导化合物及研究活性物质抗病毒机制常用的模式病毒[6]。

椴叶鼠尾草(SalviatiliifoliaVahl)是唇形科(Lamiaceae)鼠尾草属(Salvia)的一年生草本杂草[7],原产于中美洲,后随花卉引种进入昆明并迅速扩散,目前我国云南省及四川省均发现该种植物分布,且生长状况良好,是一个具有高入侵风险的物种[8]。有研究发现,其成分克罗烷型二萜化合物dugesin F、tiliifolin E分别具有抗流感病毒FM1[9]和神经营养活性[10],tilifodiolide具有抗炎活性和镇痛作用[11]。为加深对椴叶鼠尾草的资源化利用,本文对其全草进行化学成分及抗烟草花叶病毒活性测定,旨在为开发新型植物源抗病毒制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

椴叶鼠尾草(Salviatiliifolia)全草于2018年9月采自云南昆明,植物样品由西南林业大学林学院胡世俊副教授鉴定,标本存放于西南林业大学森林灾害预警与控制重点实验室。

1.1.2 病毒与寄主

烟草花叶病毒普通株系U1由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供,在普通烟草K326(NicotianatabacumL.cv.K326)上繁殖,采用文献[12]的方法对其进行纯化,并保藏于-80 ℃冰箱中备用。TMV局部枯斑寄主心叶烟(Nicotianaglutinosa)用于半叶枯斑法实验,漂盘育苗,并在无虫温室培育,待烟苗长至5片左右真叶时,挑选大小相似的健康植株供试。

1.1.3 仪器与试剂

AM-500 MHz、AV-600 MHz核磁共振仪(德国布鲁克公司);HTC/Esquire质谱仪(德国布鲁克公司);ZF-6三用紫外分析仪(254 nm和365 nm)(上海嘉鹏科技有限公司);N-1100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)。GF254薄层层析硅胶板、柱层析硅胶(青岛海洋化工厂);Lichroprep RP-18反向硅胶柱层析材料(德国默克公司);Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB公司);甲醇、乙腈(色谱纯,上海星可高纯溶剂有限公司);甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿和丙酮(化学纯,云南利妍科技有限公司)经重蒸后使用;二甲基亚砜(分析纯,天津市光复精细化工研究所);8%宁南霉素水剂(德强生物股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 提取与分离

椴叶鼠尾草风干粉碎后干质量为5.00 kg,用95%乙醇加热回流提取3 h,共计4次后合并提取液,用旋转蒸发仪回收溶剂,得乙醇提取物,加蒸馏水充分溶解,依次用石油醚、乙酸乙酯同体积萃取3次,合并萃取液并减压浓缩干燥得石油醚萃取物(113.82 g)、乙酸乙酯萃取物(11.02 g)。

石油醚萃取物经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=100∶1～1∶1,体积比)梯度洗脱,TLC检测合并相同成分后得9个馏分(Fr1～Fr9)用于活性测定。

乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析(石油醚∶丙酮=30∶1～1∶1,体积比)梯度洗脱得7个馏分(Fr1′～Fr7′),Fr4′经(三氯甲烷∶甲醇=1∶1,体积比)凝胶柱色谱分离得3个馏分(Fr4′.1～Fr4′.3),Fr4′.1经MCI(甲醇∶水=1∶0～0∶1,体积比)脱去色素得4个馏分(Fr4′.1.1～Fr4′.1.4),Fr4′.1.2经正相硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=30∶1～10∶1,体积比)梯度洗脱得5个馏分(Fr4′.1.2.1～Fr4′.1.2.5),Fr4′.1.2.1经正相硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1,体积比)洗脱,重结晶后得35.30 mg化合物2。Fr4′.1.2.2经(三氯甲烷∶甲醇=1∶1,体积比)凝胶柱色谱分离得4.20 mg化合物3。Fr4′.2经(三氯甲烷∶甲醇=1∶1,体积比)凝胶柱色谱分离得3.60 mg化合物4。Fr4′.3经(三氯甲烷∶甲醇=1∶1,体积比)凝胶柱色谱分离得5.20 mg化合物5。Fr5′经(三氯甲烷∶甲醇=1∶1,体积比)凝胶柱色谱分离得3个馏分(Fr5′.1～Fr5′.3),Fr5′.2经正相硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=8∶1～1∶1,体积比)梯度洗脱得7个馏分(Fr5′.2.1～Fr5′.2.7),Fr5′.2.1经(三氯甲烷∶甲醇=1∶1,体积比)凝胶柱色谱分离得30.10 mg化合物1。

1.2.2 抗TMV侵染活性测定

萃取物、化合物分别用DMSO溶解,配制成100 mg/mL萃取物和10 mg/mL化合物于4 ℃冰箱保存。临用时用蒸馏水将萃取物稀释至1 mg/mL,化合物稀释至50 μg/mL,阳性对照8%宁南霉素水剂稀释至50 μg/mL。

采用活体半叶枯斑法,选择健康且长势一致的心叶烟,每株挑选中上部大小相似的3片叶,每片叶的一半用提取物处理,另一半对照用相同浓度的DMSO水溶液处理,用3种方式进行施药:(1)先施药:接种病毒前6 h将提取物喷洒在烟叶上,测定提取物对寄主植物烟草的保护作用;(2)后施药:接种病毒6 h后将提取物喷洒在烟叶上,测定提取物对接种病毒烟苗的治疗作用;(3)混合施药:将提取物与病毒混合30 min后摩擦接种在烟叶上,测定提取物对病毒本身的钝化作用。病毒稀释400倍后通过金刚砂摩擦接种至叶片,待稀释液挥发完全,用蒸馏水将残余金刚砂冲洗干净。将烟苗放入无虫温室培育,3 d后枯斑症状明显,统计枯斑数,每个处理重复3次,按公式计算抑制率:

1.2.3 抑制病毒增殖活性测定

选取生长健康,长势一致的普通烟,以喷施50 μg/mL的单体化合物作为处理;喷施同等质量浓度的DMSO水溶液作为对照;喷施相同质量浓度的宁南霉素作为阳性对照。整株均匀施药24 h后,每株烟选择上部一片叶摩擦接种TMV,待叶片溶液挥发完全后将金刚砂洗净,放入无虫温室培养。健康对照喷施相应质量浓度的DMSO,不接种TMV。在培养3、5、7 d时分别用打孔器取直径为1 cm的叶圆片,每片叶取10个圆片放入离心管,保存于-80 ℃冰箱,每个处理重复3次,取样完成后以间接ELISA法测定OD405值[13]。

1.3 数据处理

根据抑制率公式计算出椴叶鼠尾草各萃取物与各化合物对TMV抑制率。并用SPSS 17.0软件对同种作用方式不同提取物和化合物的抑制率进行方差分析和LSD差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 化合物结构

从椴叶鼠尾草中共分离出5个化合物,根据理化性质及波谱数据鉴定化合物为(1)tilifodiolide[14];(2)eupa-tori acid[15];(3)ursolic acid(熊果酸)[16];(4)oleanolic acid(齐墩果酸)[17];(5)2-methyl-5,7-dioxy chromone(2-甲基-5,7-二羟基色原酮)[18],包括3个三萜类化合物、1个二萜类化合物和1个色酮类化合物,见图1。

图1 5种化合物结构Figure 1 Structures of five compounds

2.2 萃取物抗TMV侵染活性

萃取物抗TMV侵染活性结果见表1,研究发现石油醚萃取物对心叶烟的保护作用较强,抑制率为40.95%,与阳性对照宁南霉素(49.12%)无显著差异;乙酸乙酯萃取物对心叶烟具有一定的保护作用,抑制率为24.72%,显著低于阳性对照宁南霉素。乙酸乙酯萃取物对心叶烟的治疗作用最强,抑制率达52.85%,高于阳性对照宁南霉素(35.97%),石油醚萃取物治疗作用抑制率为30.61%,低于阳性对照宁南霉素。石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物对TMV钝化作用的抑制率分别为52.85%和48.66%,与阳性对照宁南霉素(51.26%)无显著差异。

表1 椴叶鼠尾草各萃取物抗TMV侵染活性Table 1 Anti TMV activity of Salvia tiliifolia extracts

2.3 石油醚馏分抗TMV侵染活性

采用半叶枯斑法对石油醚萃取物的9个馏分进行抗TMV活性测定(表2),发现各馏分对TMV均有一定的抑制作用。Fr7、Fr1、Fr9馏分对心叶烟的保护作用较强,抑制率分别为40.51%、35.16%、32.53%,与阳性对照宁南霉素(54.65%)无显著差异,其余馏分抑制率在10.12%～27.73%。Fr7、Fr5馏分对心叶烟的治疗作用较强,抑制率分别为45.52%、35.20%,与阳性对照宁南霉素(47.58%)无显著差异,其余馏分在治疗作用中的抑制率为11.16%～26.95%。Fr6馏分对心叶烟的钝化作用最强,抑制率为74.63%,显著高于阳性对照宁南霉素(53.03%),此外Fr3、Fr9、Fr4、Fr5的钝化作用也较强,抑制率依次为62.17%、50.03%、47.51%、42.31%,与阳性对照宁南霉素无显著差异,其余馏分钝化作用抑制率在7.41%～30.81%。

表2 椴叶鼠尾草石油醚馏分抗TMV侵染活性Table 2 Anti TMV activity of petroleum ether fractions from Salvia tiliifolia

2.4 乙酸乙酯馏分抗TMV侵染活性

表3为乙酸乙酯萃取物的7个馏分抗TMV活性结果,结果表明,Fr1′、Fr3′馏分对心叶烟的保护作用最强,抑制率为61.77%、55.22%,与阳性对照宁南霉素(54.65%)无显著差异,其余馏分保护作用的抑制率在12.89%～22.22%。在治疗作用中Fr3′馏分活性最强抑制率为55.02%,高于阳性对照宁南霉素(47.58%),其次为Fr7′抑制率为47.75%,与宁南霉素无显著差异,除Fr2′无治疗作用外,其余馏分治疗作用的抑制率为11.94%～33.31%。馏分Fr4′、Fr7′、Fr3′、Fr5′对TMV均有较强的钝化作用,抑制率分别为60.22%、54.93%、52.48%、44.55%,与宁南霉素(53.03%)无显著差异,除Fr1′无钝化活性外,其余馏分钝化作用的抑制率在24.35%～37.02%。

表3 椴叶鼠尾草乙酸乙酯馏分抗TMV侵染活性Table 3 Anti TMV activity of Salvia tiliifolia ethyl acetate fractions

2.5 化合物抗TMV侵染活性

对乙酸乙酯萃取物分离出的5个化合物进行抗TMV活性测定(表4),化合物1、化合物4表现出较弱的保护作用,抑制率分别为3.94%和17.45%,显著低于阳性对照宁南霉素。在治疗作用中,各化合物对TMV的侵染均有一定的抑制作用,抑制率在5.60%～23.73%,显著低于阳性对照宁南霉素,其中,化合物2治疗作用较好,抑制率为23.73%,其次为化合物5,抑制率为18.55%。在钝化作用中,各化合物对TMV的侵染均有一定的抑制作用,抑制率在6.61%～26.29%,但均显著低于阳性对照宁南霉素,其中,化合物2的钝化作用较强,抑制率为26.29%。

表4 化合物抗TMV侵染活性Table 4 Anti TMV activity of compounds

2.6 抑制病毒增殖活性

通过普通烟叶圆片法与ELISA间接法相结合,检测3、5、7 d时叶片中病毒外壳蛋白含量积累情况,测定OD405值以反映化合物是否具有抑制病毒活性。ELISA法检测结果显示(图2),3 d与7 d时化合物5和5 d时化合物4处理的烟叶中病毒积累量小于宁南霉素,有较好的抑制病毒活性作用。全部化合物的OD405值均比健康对照的数值高,但比对照病叶的数值低,因此化合物都具有一定的抑制病毒活性。

图2 化合物ELISA间接法检测结果Figure 2 Compound ELISA indirect method test result

3 讨论与结论

通过心叶烟活体半叶枯斑法,测定了椴叶鼠尾草石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、上述两种萃取物不同柱层析馏分以及从乙酸乙酯萃取物中分离出的5个单体化合物对TMV侵染的抑制活性,研究发现石油醚萃取物对TMV浸染心叶烟具有较强的保护作用(40.95%),与阳性对照宁南霉素(49.12%)无显著差异,并且该萃取物对TMV的钝化作用也最强(52.85%),高于阳性对照宁南霉素(51.26%);乙酸乙酯萃取物的治疗作用最强(52.85%),高于阳性对照宁南霉素(35.97%)。对萃取物各馏分的活性结果比较发现,不同馏分间活性有明显差异,在石油醚萃取物各馏分中,Fr7的保护作用和治疗作用最好;Fr6的钝化作用最好。乙酸乙酯萃取物各馏分中,Fr1′的保护作用最强;Fr3′的治疗作用最强;Fr4′的钝化作用最强。说明活性成分具有一定集中性,可能是因为不同馏分中化合物极性不同导致的活性差异,在后续的研究中需进一步通过活性追踪寻找具体活性成分。

在分离出的化合物中,化合物4(齐墩果酸)的保护作用与抑制病毒活性作用最强,化合物2(eupatoric acid)的治疗作用与钝化作用最强,这两个化合物均为三萜类化合物。我们前期研究也曾发现苦木素等三萜类成分具有较好的抗TMV活性[19]。化合物相较于萃取物与各馏分,抑制率有较大差异,可能是因为分离出的化合物主要富集在乙酸乙酯萃取物Fr4′和Fr5′馏分,该馏分段虽有较好的钝化作用,但保护作用和治疗作用相对较弱,还可能因为植物中含有多种化学成分,各成分间出现复杂的作用关系,从而产生拮抗效应或协同效应[20],Chen等[21]在研究苦木的抗TMV活性时曾发现其中的生物碱和苦木素存在协同增效作用。

烟草花叶病毒是一种寄生性的系统侵染病毒,病毒粒子入侵寄主获取营养完成生活与繁殖,与寄主融为一体同时破坏寄主组织细胞,因此,目前的抗病毒药剂很难在不伤害寄主植物的情况下选择性杀死病毒,普通药剂对病毒只有短时间的效果,长期使用会使病毒产生耐药性且对植物有一定副作用,而植物源抗病毒制剂具有易降解、组分多元、选择性强等优势,所以本文对椴叶鼠尾草化学成分进行了抗TMV侵染活性测定,发现其化学成分对TMV具有一定程度的抑制作用,可为资源化利用入侵植物椴叶鼠尾草,为其变废为宝提供一定的理论依据。