LY294002通过PI3K/Akt通路对结直肠癌RKO细胞增殖及凋亡的影响

张恒 李康宁 董海峰 郑英斌

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是最常见的消化道肿瘤之一，其发病率和死亡率均较高，目前仍缺乏有效的治疗方法来改善患者预后[1]。我国CRC 的发病率和死亡率也逐年上升，给社会及患者带来了巨大的负担[2]。CRC 的临床治疗方式主要是手术治疗、药物治疗及放射治疗等，对于早期CRC 一般采用手术治疗，为防止术后出现复发、再发、转移等，通常于术后周期性使用药物治疗；而对于中晚期患者，采取手术治疗或在术前通过新辅助治疗缩小肿瘤，以为进一步手术提供可能，或是通过一系列药物治疗来减缓、控制病情发展[2，3]；因此，药物在CRC 的治疗中有极其重要的作用，而通过研究更有效的药物制剂对于临床诊疗意义重大。大量研究已证实PI3Ks 信号级联反应的过度激活是癌症发展的标志，尤其是I 类PI3Ks，当I 类（p110α、p110β、p110γ 和p110δ）催化亚基与P85 调节亚基结合时，它们的激活导致Akt 的苏氨酸（Thr308）和丝氨酸（Ser473）磷酸化，从而激活mTOR，进而在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用[4，5]。因此，PI3K/Akt 通路在CRC 的研究中是不可忽视的；Bcl-2/Bax 是调控细胞凋亡的重要基因，而PI3K/Akt通路与Bcl-2/Bax 的表达关系密切[6]，需要进一步探究CRC 中该通路是否显著改变了Bcl-2/Bax 的表达量。本研究在CRC RKO 细胞中，采用LY294002抑制PI3K/Akt 通路的激活发现RKO 细胞的增殖能力削弱，基于此，作者对相关机制进行研究，为LY294002 在人CRC 的治疗应用方面提供实验基础和理论依据，并为其他药物治疗的可能性提供方向和指引。

1 材料与方法

1.1 材料本研究收集了2019 年1 月～2020 年12月期间我院收治并确诊的CRC 并进行手术的患者的癌组织（71 例）及癌旁组织（48 例）蜡块标本。本研究经我院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。购买人CRC RKO 细胞（中国科学院上海细胞研究所），DMEM 细胞培养液（Gibco 公司），10%胎牛血清（FBS，杭州四季青生物材料有限公司），LY294002（Gibco 公司），CCK-8 试剂盒（碧云天生物技术研究所公司），p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2、GAPDH 一抗（Cell Signaling 公司），过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 及ECL 高灵敏度化学发光试剂盒（碧云天生物技术研究所）；凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 HE 染色 标本均经福尔马林液固定，常规脱水、石蜡包埋，5μm 厚切片，将切片放置65℃烘烤30min。放置于二甲苯中脱蜡，5min/次，共操作3 次，依次放置于无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75% 乙醇中，最后用清水冲洗，30s/次，时间控制在10min 内进行苏木精染液染色，自来水洗，采用1%盐酸乙醇分化液分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水反蓝，15min 以上流水冲洗，细胞核颜色变为蓝色，放置伊红液（1%）染色60s，自来水略洗，依次放置于85%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、无水乙醇中进行脱水，30s/次，二甲苯透明，1min/次，共操作3 次，盖片封片后于显微镜下观察。

1.2.2 免疫组化 标本均经福尔马林液固定，常规脱水、石蜡包埋，5μm 厚切片，将切片放置65℃烘烤30min。放置于二甲苯中脱蜡，5min/次，共操作3次，依次放置于无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中，最后用清水冲洗，30s/次。经抗原修复后，置于3%过氧化氢室温孵育20min 以消除内源性过氧化物酶的活性。清洗后，将切片置于5%BSA中，37℃，封闭2h。一抗、二抗及DAB 染色剂均按说明书配置。苏木精染液染色采用1%盐酸乙醇分化液分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水反蓝，15min以上流水冲洗，细胞核颜色变为蓝色后，再次透明化，树胶封存。免疫组化评估：阳性细胞百分比评分：无阳性细胞为0 分，阳性细胞1%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，76%～100%为4 分。染色强度评分：无染色为0 分，弱染色为1 分（+），中等强度染色为2分（++），强染色为3分（+++）。总评分=阳性细胞百分比×染色强度评分，0～4 分为p-Akt 低表达，5～12 分为p-Akt 高表达。

1.2.3 细胞培养与传代 采用DMEM 完全培养基培养RKO 癌细胞株（含10% 胎牛血清和1% 青霉素-链霉素溶液），待RKO 细胞在生长到大约90%后传代。

1.2.4 细胞分组 取对数生长期细胞1×105个/mL接种于细胞培养瓶。参照细胞学预实验结果选取药物浓度及分组，将实验细胞分为3 组：①空白对照组（Blank 组），仅有DMEM 完全培养基培养；②阴性对照组（DMSO 组）：向DMEM 完全培养基中加入二甲基亚砜（DMSO）；③阳性对照组(LY294002 组)：向DMEM 完全培养基中加入终浓度为20μmol/L的LY294002。

1.2.5 对细胞增殖的影响 将RKO 细胞（3×103细胞/孔）接种于96 孔板，根据实验分组处理或不处理24、48、72h。每孔加入10μL CCK-8 溶液至96 孔板，细胞培养箱内继续孵育2h，于入射光波长450nm 处测定吸光度值，实验重复3 次。

1.2.6 凋亡实验 取处于对数生长期细胞，按实验分组进行不同处理，将各组的RKO 细胞消化离心（1 000r/min，4℃，10min）后收集至15mL 离心管中。每管加入约2mL PBS 缓冲液轻轻洗涤管内细胞，洗去杂质，再次离心，弃去上清，每管加入500μL 结合液，于避光条件下加入FITC 和PI 染料混匀后立即上机进行检测。采用Flowjo 10.0 软件进行统计分析。

1.2.7 Western blot 检测Akt、p-Akt、Bax 和Bcl-2 表达 将各组细胞置于细胞培养箱中培养48h 后分别收集细胞，提取细胞总蛋白，以GAPDH 为内参，BCA 定量分别得出样品蛋白浓度。配制分离胶和浓缩胶，调整蛋白上样浓度一致，先将电压调至80V使蛋白样品下沉至分离胶起始部，随后调整电压至120V（观察电泳时确认电压是否稳定，条带是否整齐下压），当样品临近底部时终止电泳，将PVDF 膜浸泡在含5%脱脂奶粉的TBST 中，在小摇床中封闭1h 后，加一抗4℃孵育过夜，按说明书比例室温孵育二抗2h，随后用凝胶成像仪进行显影曝光并记录灰度值，蛋白相对含量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.3 统计学分析采用 SPSS 16.0 统计学软件分析数据，计量资料组间比较采用t检验，连续变量的多组间比较采用重复测量的方差分析，非连续变量的多组间比较采用单因素方差分析，用表示；计数资料组间比较采用χ2检验，用率表示。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 p-Akt 在人CRC 组织中的表达情况我们对纳入的CRC 患者的组织进行HE 染色和免疫组化分析。p-Akt 阳性定位在CRC 细胞细胞质中，结果如图1 所示，71 例CRC 患者RKO 细胞中p-Akt 蛋白高表达者60例（84.51%），低表达者1例（15.49%）；48 例CRC 患者癌旁组织细胞中p-Akt 蛋白高表达者10 例（20.83%），低表达者38 例（79.17%）；患者CRC 组织中p-Akt 高表达率较癌旁组织显著升高，差异具有统计学意义（χ2=47.937，P＜0.0001）。

2.2 LY294002 对CRC RKO 细胞增殖的影响CCK-8法对各组进行细胞增殖实验。结果如表1 所示，LY294002 组RKO 细胞的增殖较其他两组受限，活力下降，且随着LY294002 作用时间的延长，LY294002 组的RKO 细胞活力持续低下，且差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组中RKO 细胞的增殖情况

2.3 LY294002 对CRC RKO 细胞凋亡的影响根据细胞凋亡实验结果如图2，与Blank 组及DMSO组相比，LY294002 组的RKO 细胞凋亡数量明显增多，差异具有统计学意义（P＜0.0001）。

图2 LY294002 对CRC RKO 细胞凋亡的影响注：与Blank 组和DMSO 组比较，****P＜0.0001

2.4 LY294002 对CRC RKO 细胞PI3K/Akt 信号通路的影响为了进一步验证各组RKO 细胞的PI3K/Akt 信号通路的表达情况，采用 Western blot法检测各组细胞中p-Akt、Akt、Bax 和Bcl-2 的蛋白表达变化，结果显示，LY294002 组与其他两组相比，Akt 的总蛋白无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）；p-Akt、Bcl-2 明显降低，Bax 表达水平显著增高，且差异均具有统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 各组RKO 细胞Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2 蛋白表达检测结果

3 讨论

CRC 发病率居全球恶性肿瘤第3 位，且不断提高。近年来，虽然临床医学水平发展迅速，CRC 的早期筛查及临床治疗方案多样化并快速发展，但CRC 患者的生存率却未得到显著提高；现今CRC 临床治疗以手术及化学治疗为主，据相关研究显示，CRC 患者对相关化学药物耐药是生存率降低的主要因素之一[7～9]；相关药物治疗在CRC 治疗方案中扮演着重要角色，这些药物大多通过调控癌细胞生物学行为而发挥作用，因此关于某些生物学标志物和治疗靶点的研究就显得尤为重要[10]。LY294002是第一种人工合成的PI3K/Akt 通路特异性抑制剂，通过竞争性抑制PI3K 的ATP 结合位点来阻碍PI3K 表达[11]，其作为PI3K 的广谱抑制剂，许多研究表明其对食管癌、肿瘤相关血管内皮细胞及干细胞，卵巢癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤细胞有抑制及减灭作用[12～16]。对某些临床联合用药（降糖药物，化疗药物、靶向药物等抗肿瘤药物）及一些提取物（从某些植物、动物、细菌等中提取）研究发现，与单独使用各种药物相比，联合用药能够增强对肿瘤细胞生长抑制及促进肿瘤细胞凋亡等作用。在CRC 方向的LY294002 与PI3K/Akt 通 路相关研究中，少有关于PI3K/Akt 通路与其密切相关的Bcl-2/Bax 蛋白表达情况相联合的研究与思考，本研究探索LY294002 通过PI3K/Akt 通路抑制CRC RKO 细胞增殖并促进其凋亡的机制。

PI3K/Akt 通路是重要的细胞内信号传导通路，已被广泛证明参与细胞生长、增殖、凋亡和分化调控等多种代谢过程。PI3K 作用于Akt，使其发生磷酸化从而被激活，磷酸化的Akt 能够调控c-myc 等促进细胞增殖，也能促进细胞成熟、肿瘤血管生成等；此外，PI3K/Akt 是多条信号通路中的中心位点之一，还可被EGFR、RAS、IRS1、JAK、FAK、c-met等多种上游分子激活[17，18]。这种信号的异常激活已在包括食管癌、肿瘤相关血管内皮细胞及干细胞，卵巢癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌等在内的人类癌症中广泛报道[19，20]；且有报道称，一些抗癌药物可以通过阻断PI3K/Akt 通路抑制肿瘤细胞增殖[21]。Bcl-2/Bax 为人体内各种细胞凋亡因子，调控着细胞的凋亡过程，线粒体是人体细胞中一个细胞器，也是内在凋亡途径的中心，其受Bcl-2/Bax 的调控；Bax 是促凋亡因子，在调控细胞凋亡方面有极其重要的作用，是Bcl-2 基因家族的一种，其编码翻译的Bax 蛋白为凋亡启动程序的一个上游蛋白，促使细胞凋亡；Bcl-2 是抗凋亡因子，可与Bax 拮抗，从而抑制细胞凋亡；蛋白Bax 可结合Bcl-2 蛋白并拮抗Bcl-2 蛋白，Bcl-2 与Bax 在调控凋亡方面相互拮抗，相互制约，共同维护细胞正常更替、凋亡的过程，故可通过调整两者强弱关系打破平衡，控制凋亡进程[22，23]。本研究发现CRC 组织较癌旁组织的p-Akt 水平显著升高；根据细胞增殖实验，LY294002 影响下的RKO 细胞活力较另外两组明显降低，差异具有统计学意义；根据细胞凋亡实验，LY294002 影响下的RKO 细胞凋亡数量较对照组明显增多，差异具有统计学意义；同时，根据Western blot 检测结果，各组Akt 总蛋白结果无明显差异，LY294002 组p-Akt 蛋白较另外两组明显降低，表明LY294002 抑制了PI3K/Akt 通路，LY294002 组Bax 表达水平显著增高，Bcl-2 表达水平显著降低，并抑制了CRC RKO 细胞的增殖，促进其凋亡；因此，LY294002 是通过促进Bax、抑制Bcl-2 的表达，从而诱导细胞凋亡。本研究中Bcl-2/Bax 所受调控唯一性以及力度大小还无法完全确认，LY294002是否通过其他途径影响CRC RKO 细胞的增殖、凋亡也无法确认；对于药物敏感强弱的机制也仍不清楚，有待于进一步的研究探索。

综上所述，本研究探讨了LY294002 作用于CRC RKO 细胞后其增殖与凋亡表现，发现LY294002 明显抑制CRC RKO 细胞的增殖，促进其凋亡，显著杀灭了CRC RKO 细胞，这与其能抑制PI3K/Akt 通路有关，也体现了Bcl-2/Bax 的重要性，表明LY294002 用于CRC 治疗具有一定的价值，为CRC 的临床用药及药理方向研究提供了思路。