弱精子症合并超重人群精液PRDX2的表达变化与运动能力的相关性分析

胥国麟，叶晓林，钱体军，王云涛，赵文珍

（大理大学基础医学院，云南 大理 671000）

不孕不育群体的人群数量逐年增加，其中男性因素导致的不育达到50%〔1〕。对于男性不育而言，弱精子症是目前较为关注的疾病之一，导致弱精子症的原因很多，其中活性氧损伤被认为是最主要的原因之一〔2〕。目前，随着超重人数的增加，超重人群与弱精子症之间的关系被广泛关注，肥胖症是一种慢性代谢性疾病，能形成过量的活性氧造成慢性全身性损伤，可能会导致精子活力降低及精子畸形率增加〔3〕。过氧化物还原酶家族成员过氧化物还原酶2（peroxiredoxin 2，PRDX2），在卵巢、睾丸、附睾及哺乳动物精子中均有表达，该家族被认为是清除活性氧最有效的家族之一，能够维持细胞稳态平衡〔4〕。既往研究〔5-6〕证实，PRDX2能与Lgals9共同调节超重引起的肥胖症，能减缓冷冻精子活力的下降，与精子DNA 损伤程度相关，虽然该研究证实PRDX2 的抗氧化作用与精子活力有一定的相关性，但缺乏临床证据描述PRDX2与超重者之间的相关性，尤其是弱精子症合并超重者精子中PRDX2 的表达情况尚未见报道，故本研究通过收集弱精子症合并超重人群的精液标本，分析PRDX2 在其精子中表达差异，初步探究PRDX2 与弱精子症合并体质量超重之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂正置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司，型号：BX53）；PRDX2 抗体（Abcam 公司，批号：ab109367）；Alexa Flour 488 标记的山羊抗兔IgG（Abcam 公司，批号：ab6712）；磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer solution，PBS，实验室自制）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，Sigma 公司，批号：V900933-100G）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）荧光染料（碧云天生物技术公司，批号：C1002）。

1.2 研究对象收集2021年1月至12月大理大学第一附属医院生殖中心精液常规检查的101 份精液标本进行研究。精液样本的使用经大理大学第一附属医院医学伦理委员会审批通过，所有实验根据相关指南和规定进行，精液提供者均知情同意并签署知情同意书。

1.3 精液标本准备本研究中精液检查者需满足以下条件：①禁欲3~7 d；②年龄20~47岁；③无长期服药史，无高血压、糖尿病等慢性疾病，无精索静脉曲张等先天性生殖系统疾病或后天生殖系统疾病。精液常规参数由大理大学第一附属医院生殖中心检验科提供。弱精子症诊断标准：按照WHO《人类精液检验与处理的实验室手册》（第5 版）中的标准，将精液标本中前向运动精子百分数（progressive motility，PR）小于<32%者确定为弱精子症。依据体重指数（body mass index，BMI）将受试者分为：正常体重者（18 kg∕m2≤BMI<25 kg∕m2）、超重者（BMI≥25 kg∕m2）和肥胖者（BMI≥30 kg∕m2）。将同时符合正常体重及正常活力精子的精液标本纳入正常组（60份），将同时符合超重或肥胖及弱精子症的精液标本纳入弱精超重组（41份）。

1.4 参数检测通过精液计算机辅助分析系统检测精液常规参数，包括：精子密度、精子活率、PR、直线速率（straight-line（rectilinear）velocity，VSL）、平均轨道速率（average path velocity，VAP）、曲线速率（curvilinear velocity，VCL）、直向（straightness，VSL∕VAP，STR）、摆动（wobble，VAP∕VCL，WOB）、线性（linearity，LIN）、头侧摆幅度（amplitude of lateral head displacement，ALH）、交打频率（beat-cross frequency，BCF）等。

1.5 免疫荧光检测新鲜精液标本800g，4 ℃条件下离心10 min，取精子沉淀物用PBS 洗涤3 次制成精子涂片，-80 ℃长期保存。4%多聚甲醛固定精子涂片30 min，PBS 洗涤3 次，0.1%Triton X-100 打孔10 min，再次PBS 洗涤3 次；5% BSA 室温封闭1 h，一抗PRDX2（1：200 稀释），阴性对照用PBS 取代，4 ℃孵育过夜；二抗IgG（1：500）室温避光孵育1 h，PBS 洗涤3 次，每次5 min，使用带DAPI 的防荧光淬灭剂封片，予以相同曝光时间及曝光度进行荧光显微镜拍照。

1.6 统计分析采用SPSS 21.0、Image J 及Prsim 8软件进行统计学分析和作图，符合正态分布的计量资料用（±s）表示，组间差异分析使用t检验；使用Pearson 相关分析探讨PRDX2 表达量与精液参数的相关性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组人群一般资料比较与正常组人群比较，弱精超重组患者的BMI 显著升高，精子密度、精子活率、PR、STR、LIN、VCL、VSL、VAP等参数显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；2 组人群年龄，WOB、ALH、BCF 等参数差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 2组人群一般资料比较（±s）

表1 2组人群一般资料比较（±s）

注：与正常组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

项目正常组（n=60）弱精超重组（n=41）项目正常组（n=60）弱精超重组（n=41）年龄∕岁BMI∕（kg∕m2）精子密度∕（107个∕mL）精子活率∕%PR∕%STR∕%LIN∕%31.90±5.15 21.46±1.68 38.18±31.58 72.46±14.64 57.18±14.28 85.69±5.07 64.90±8.95 33.07±7.71 27.06±2.64**26.55±25.22*31.47±18.98**17.55±9.96**79.21±16.76*59.34±17.17*WOB∕%VCL∕（μm∕s）VSL∕（μm∕s）VAP∕（μm∕s）ALH∕μm BCF∕Hz 73.33±7.48 49.10±11.48 33.01±8.92 37.04±9.25 2.81±1.38 4.96±1.13 69.28±15.91 36.90±14.68**22.49±10.55**25.75±11.04**2.41±5.53 5.26±2.21

2.2 精子中PRDX2 的定位与表达免疫荧光结果显示，PRDX2主要定位于精子的中段线粒体处及部分头核处，弱精超重组精液中PRDX2的荧光表达量显著低于正常组（P<0.001）。见图1。

图1 PRDX2在2组精子中的定位与表达

2.3 PRDX2 荧光表达量与精液参数的相关性分析相关性分析结果显示，PRDX2荧光表达量与BMI呈负相关（r=-0.857，P=0.002），与PR 呈正相关（r=0.827，P=0.003），与年龄及其他精液参数无相关性。见表2。

表2 PRDX2荧光表达量与精液参数的相关性分析

3 讨论

全球男性生育率的下降与精子密度减少及其活力下降密切相关。肥胖、饮食、慢性病、吸烟以及环境毒素等因素都可能是导致男性不育的主要因素〔7〕。其中，弱精子症是目前男性不育的主要疾病之一，其病因多种多样，通常包括泌尿系统感染、免疫反应、染色体异常等原因，有时病因也可能不明确。研究〔8〕表明，肥胖与精子质量下降之间存在密切关联。肥胖不仅会导致雄性激素分泌减少和雌激素转化增加，还可能引起脂肪酸积累和活性氧水平升高，对精液质量和机体造成氧化应激损害。

过氧化物酶家族最初是在酵母中发现的，如今已证实其在哺乳动物中有成员存在。这个家族的成员主要用于清除由H2O2引起的活性氧，以维护细胞环境的稳态平衡〔9〕。过氧化物酶家族包括6 个成员，分别是PRDX1~PRDX6〔10〕。其中，PRDX2 是典型的2-Cys 成员，其结构与其他成员有所不同。在正常的生理条件下，PRDX2为十聚体和二聚体之间的平衡状态，从而导致其更容易被氧化〔11〕。Li 等〔12〕研究发现，PRDX2 可以作为活性氧清除剂，通过MAPK 通路来抑制动脉粥样硬化的进展。此外，Talwar 等〔13〕的研究证实，PRDX2 能与转录因子STAT3形成复合体，从而对H2O2进行还原。而Duan等〔14〕的研究发现，PRDX2有助于清除睾丸间质细胞受到的活性氧损伤，维持睾丸激素的分泌，进而保持精子的正常发育。前期研究〔14〕表明，PRDX2与细胞内环境的氧化平衡密切相关，能通过清除H2O2维持细胞的正常发育。因此，推测PRDX2可能在合并肥胖的弱精子症中发挥重要作用。

本研究使用精液样本进行了一般资料分析，对比了正常组和弱精超重组的数据。结果显示，在BMI、精子密度、精子活率以及PR方面，2组之间差异具有统计学意义，此外，弱精超重组的VCL、VSL 和VAP显著低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。有研究〔12〕发现VCL、VSL 和VAP 与受精能力呈正相关。据报道〔10〕，精子运动能力下降的主要原因包括ATP 水平降低和氧化应激的增加。上述结果提示超重弱精子症患者存在氧化应激水平增加的情况。免疫荧光结果显示PRDX2 定位于人精子的部分头核和中间线粒体处，推测PRDX2 可能参与维护精子的正常形态和保护精子DNA 免受氧化侵害，对精子后续的受精能力产生影响。既往研究〔15〕表明，PRDX2能够在相对较低的H2O2浓度下进行氧化还原反应，有效地维持细胞的氧化还原平衡。初步免疫荧光检测表明，弱精超重组的PRDX2 荧光表达量明显降低，与Liu 等〔16〕研究中发现的PRDX2在弱精子症中表达下调一致，提示PRDX2 的抗氧化能力可能受损。

相关性分析结果显示，PRDX2 的荧光表达量与BMI 呈显著负相关，与PR 呈显著正相关，但与精子密度等无显著相关性。再次验证了免疫荧光结果的可靠性，同时表明PRDX2的表达变化与精子细胞内活性氧水平的变化有关。通过本研究可知，弱精超重组中PRDX2 的表达降低表明其抗氧化能力下降，提示PRDX2 是存在于人精子中的抗氧化酶，推测PRDX2 可能损耗自身能力去维持精子的正常活力。此外，PRDX2 的表达与BMI 呈负相关，这提示PRDX2 与肥胖引起的活性氧增加有关，因此，可以推测PRDX2 的变化与精子受氧化应激而导致精子活力降低有关。然而，本研究的局限之处在于只是初步探讨了PRDX2 在超重合并弱精子症人群中的表达情况。另外，对于PRDX2在此类弱精子症中如何进行调节的分子机制仍需要深入研究。

综上所述，本研究再次验证了肥胖与弱精子症之间的相关性，并首次在超重人群的弱精子症患者的精子中描述了PRDX2 的表达情况，提示其PRDX2 的改变与精子活力低下之间可能通过调节活性氧影响体质量来实现，为进一步研究超重弱精子症治疗提供基础。