天然低共熔溶剂促进纤维素酶水解橄榄苦苷的研究

王明明,陈根振,胡锦霞,曾韦丹,王 晗,裴 栋,曲清莉,邸多隆,3*

1甘肃中医药大学药学院;2中国科学院兰州化学物理研究所中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室和甘肃省天然药物重点实验室,兰州 730000;3青岛市资源化学与新材料研究中心,青岛 266000;4云南油橄榄大健康产业创新研究发展有限公司,丽江 674100

油橄榄(OleaeuropaeaL.)为木犀科木犀榄属植物,是地中海地区重要的油料作物[1],甘肃、云南是我国油橄榄主要的种植地。油橄榄叶是油橄榄树种植过程中廉价的副产品。每年每棵油橄榄树大约需要修剪掉25 kg叶子,每年收获叶子的总重量占油橄榄总重量的10%。油橄榄叶中含有多种生物活性化合物。如齐墩果酸、山楂酸、熊果酸、橄榄苦苷、羟基酪醇等[2]。

研究表明,橄榄苦苷在油橄榄树中的所有部位中均有分布,其中油橄榄叶中橄榄苦苷的含量最高。在干燥的油橄榄叶中,橄榄苦苷的含量可以达到10%～17%。如图1所示,橄榄苦苷水解后生成羟基酪醇、葡萄糖和榄烯酸[3]。其中羟基酪醇表现出比橄榄苦苷更好的生物活性。目前橄榄苦苷的水解方法主要包括酸水解、碱水解和酶水解。酸水解和碱水解需要强酸强碱和高温环境,反应条件苛刻[4]。近年来,以酶作为催化剂来实现副产物的生物转化受到了重视。与传统的酸碱水解方法相比,酶水解橄榄苦苷具有反应条件温和、环境污染少等优点[5]。Liu等[3]通过纤维素酶作为食品添加剂断裂糖苷键,酶水解橄榄苦苷得到羟基酪醇。由于纤维素酶的热不稳定性[6],在酶最适温度下无法持续保持高活性,导致酶水解效率低下。因此,尝试寻找一种新的绿色溶剂代替缓冲液,在提高橄榄苦苷溶解度的基础上,增强纤维素酶在长时间反应中的稳定性,从而提高橄榄苦苷的酶水解效率。

图1 橄榄苦苷酶水解示意图

低共熔溶剂(deep eutectic solvent,DES)是氢键受体(hydrogen bond acceptor,HBA)和氢键供体(hydrogen bond donor,HBD)经高温搅拌形成的均一透明的混合物,与单个组分相比具有更低的熔点[7]。由于DES具有良好的物理化学性质,包括可燃性低、不易挥发、易制备、高溶解性和与酶的高度相容性,因此DES作为无毒提取剂和增溶剂的应用日益广泛[8]。最重要的是,酶在有机溶剂中易失活[9],DES作为溶剂可以防止这一现象发生。这也使DES代替有机溶剂,孵育纤维素酶成为可能。由天然HBA和HBD组成的DES被称为NADES,比常规DES更安全,更绿色。在酶催化反应领域NADES作为绿色溶剂受到了广泛关注[10]。NADES已成功应用于特定的酶促反应中,对酶的活性和稳定性均产生有利影响[11]。上述研究结果证明,NADES具有成为纤维素酶水解橄榄苦苷良好溶剂的可能。

本研究制备了以氯化胆碱或甜菜碱作为HBA,不同种类的多元醇作为HBD的6种NADES,考察对纤维素酶水解橄榄苦苷的影响。通过探究不同种类、不同浓度的NADES及其单体对酶水解速率的影响,构建一种高效、绿色的纤维素酶水解橄榄苦苷的新方法。

1 材料和方法

1.1 原料与试剂

干燥油橄榄叶、BMKX-4大孔树脂和橄榄苦苷标样准品(纯度≥98.89%,批号:GSB 11-3936-2021)均由中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室提供;纤维素酶(李氏木霉,酶活10 000 U/g,批号:C12894980)、氯化胆碱(批号:C13490561)、甜菜碱(批号:B802317)和柠檬酸三钠盐(批号:C14003149)(均为分析纯,纯度98%)(上海麦克林生化科技股份有限公司);1,4-丁二醇(批号:20201210,纯度≥99.0%)、1,2-丙二醇(批号:20130604,纯度≥99.5%)、丙三醇(批号:20190815,纯度≥99.0%)、乙二醇(批号20221207,纯度≥99.5%)和一水合柠檬酸(批号:20180706,纯度≥99.8%)(国药集团化学试剂有限公司);甲醇、乙腈(色谱纯,北京迈瑞达科技有限公司)。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260型高效液相色谱仪配DAD检测器(安捷伦科技有限公司,美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 橄榄苦苷提取物的制备

称取干燥油橄榄叶200 g,分别加入12倍量(m/V)和10倍量(m/V)60%乙醇回流提取2次,每次2 h,合并提取液,55 ℃减压回收乙醇至2 L,放冷过滤,得提取液。将提取液流过BMKX-4树脂富集橄榄苦苷,用1∶9(V/V)的正己烷:乙酸乙酯为洗脱液,洗脱树脂柱。回收洗脱液,干燥。得到干燥的橄榄苦苷提取物,置于干燥器中保存。

1.3.2 低共熔溶剂的制备

将不同的HBA和HBD置于具塞锥形瓶中,并在80 ℃的条件下,搅拌2 h,直至形成均匀透明液体。表1为本研究制备的不同类型DES的组分和摩尔比。表2为HBA和HBD的结构。

表1 低共熔溶剂的组成

表2 HBA和HBD的结构

1.3.3 酶水解

考察温度、时间和pH对橄榄苦苷酶水解率的影响。酶水解实验在100 mL锥形瓶中进行,水浴加热,磁力搅拌转速为150 r/min。橄榄苦苷提取物作为底物。将产物在4 000 r/min条件下离心5 min,去除不溶性残留物。HPLC检测橄榄苦苷的浓度。

1.3.4 纤维素酶水解橄榄苦苷最适温度和pH的研究

取橄榄苦苷提取物100 mg和纤维素酶10 mg加入40 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=5),分别在温度为40、45、50、55、60 ℃的水浴条件下,反应24 h。

取橄榄苦苷提取物100 mg和纤维素酶10 mg用0.5 mol/L的HCl和0.2 mol/L的NaOH调节柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH。分别在pH为3、4、5、6、7,温度为50 ℃的条件下,反应24 h。

1.3.5 不同种类DES对橄榄苦苷酶水解率的影响

取橄榄苦苷提取物100 mg和纤维素酶7 mg加入36 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液与4 mL的DES形成40 mL的10%DES-纤维素酶缓冲液系统。50 ℃水浴搅拌36 h,每3 h取样,HPLC检测橄榄苦苷浓度。

1.3.6 不同浓度DES对橄榄苦苷酶水解率的影响

取橄榄苦苷提取物100 mg和纤维素酶7 mg加入不同比例的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和DES-1,形成10%、20%、30%的DES-纤维素酶缓冲液溶剂系统。50 ℃水浴搅拌36 h,每3 h取样,HPLC检测橄榄苦苷浓度。

1.3.7 DES单体对橄榄苦苷酶水解率的影响

取橄榄苦苷提取物100 mg和纤维素酶7 mg分别向纤维素酶缓冲液系统中加入相应量的HBA和HBD。50 ℃水浴搅拌36 h,每3 h取样,HPLC检测橄榄苦苷浓度。

1.3.8 橄榄苦苷的HPLC分析

采用ZORBAX SB-Aq-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为0.3%乙酸水溶液(A)和乙腈(B);梯度洗脱:0～30 min,14%→27%;30～35 min,27%→31%B。流速为1 mL/min;进样量为20 μL;检测波长为232 nm。

分别制备浓度为0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL橄榄苦苷对照品,进样量20 μL,每个样品重复进样三次,取其峰面积平均值。如图2所示,以标准溶液中橄榄苦苷的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得标准曲线方程为y=49 371 370x+41 083,R2=0.999 4(y为峰面积;x为橄榄苦苷浓度,mg/mL)。

图2 橄榄苦苷标准曲线

1.3.9 橄榄苦苷酶水解率的计算

根据公式(1)计算橄榄苦苷的酶水解率。

R=[1-(W/W0)]×100%

(1)

式中,R为橄榄苦苷酶水解率;W1为水解后橄榄苦苷的质量(mg);W0为水解前橄榄苦苷的质量(mg)。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶水解橄榄苦苷最适温度与pH的考察

反应温度是影响纤维素酶活性、反应速率以及橄榄苦苷及其产物溶解度的重要因素,图3a显示了反应温度对橄榄苦苷酶水解率的影响。随着温度从40 ℃升高到50 ℃,橄榄苦苷的酶水解率从77.48%升高到84.54%。温度的升高有利于橄榄苦苷溶解度的增加,也加快了底物与纤维素酶之间的传质速度,促进了橄榄苦苷的酶水解。温度高于50 ℃时,橄榄苦苷酶水解率急剧下降,这是由于过高的温度,会导致纤维素酶失活[12],因此50 ℃是纤维素酶水解橄榄苦苷最适温度。

图3 温度、pH对橄榄苦苷酶水解率的影响

pH对橄榄苦苷酶水解率的影响如图3b所示,pH是影响酶活性的关键因素,pH由3增加到5时,橄榄苦苷酶水解率从67.42%迅速增加到84.54%。当pH高于5时,橄榄苦苷的酶水解率急剧下降。这是由于纤维素酶是一种弱酸性的酶,并且pH的任何变化都可能改变蛋白质中氨基酸的电离态。因此,酶的形态甚至底物的电荷性质都会受到pH的影响,从而影响底物与酶的结合,最终影响反应速率[13]。当pH为中性或者弱碱性时,纤维素酶很容易失活。因此纤维素酶水解橄榄苦苷的最适pH为5。

2.2 不同种类DES对橄榄苦苷酶水解率的影响

本研究筛选了6种以氯化胆碱或甜菜碱为HBA,不同多元醇为HBD组成的NADES(10%,V/V)对纤维素酶水解橄榄苦苷速率的影响进行了研究。图4、图5分别表示在缓冲液和10%DES-1为溶剂系统下橄榄苦苷酶水解前后的HPLC色谱图(温度为50 ℃,pH=5),色谱图右侧为对应的水解时间。色谱图中1号峰为羟基酪醇,2号峰为橄榄苦苷。由图6可以看出,本研究筛选的6种NADES对纤维素酶水解橄榄苦苷都具有一定的促进作用。由图6可以看出,多元醇为氢键供体的DES对橄榄苦苷的酶水解都具有一定的促进作用,但不同的DES之间对橄榄苦苷酶水解速率也存在着差异。如图7所示,在水解3 h时,多数DES对橄榄苦苷酶水解速率影响很小。通过显著性分析发现,DES-1、2、6相比于缓冲液系统,并没有显著性(P>0.05);而DES-3、4、5为极显著(P<0.01)。且DES-5在水解3 h后,其对橄榄苦苷酶水解率是缓冲液的1.7倍,其橄榄苦苷酶水解率远高于其他DES和缓冲液;在水解18 h后,由氯化胆碱和丙三醇组成的DES表现出最好的酶解效果,这可能是因为DES-4能更好增加纤维素酶的稳定性,使其长时间保持良好活性。

图4 橄榄苦苷在缓冲液中不同酶水解时间的HPLC色谱图

图5 橄榄苦苷在10%DES-1中不同酶水解时间的HPLC色谱图

图6 缓冲液与不同种类DES橄榄苦苷酶水解率曲线

图7 不同种类DES对橄榄苦苷酶水解率的影响

多元醇作为氢键供体在生物催化方面的应用有许多报道,其在提高多种酶的活性和稳定性方面表现出广泛的适应性。Jeng等[14]研究表明,基于氯化胆碱和丙三醇组成的DES延长了脂肪酶的半衰期,增加了脂肪酶在40 ℃时的稳定性,在最佳的HBA/HBD比例下使得脂肪酶的半衰期增加了9.2倍。基于甜菜碱和木糖醇组成的25%NADES(V/V)提高了漆酶的热稳定性,使其在70 ℃的条件下,仍然保持较高的活性[15]。据报道,多元醇可以稳定蛋白质三级结构,从而提高酶的稳定性[16]。为了更好地了解多元醇在分子水平上对酶活性和稳定性的影响,Varriale等[15]采用分子对接模拟了多元醇与漆酶的活性位点间的相互作用。结果表明,多元醇的羟基与漆酶活性氨基酸形成氢键相互作用,这些氢键相互作用是促进漆酶活性及其稳定性的重要因素。Sanchez等[17]通过分子动力学模拟也证明了丙三醇为HBD的DES对α-胰凝乳蛋白酶和溶菌酶均能提高其稳定性,并且由氯化胆碱和丙三醇组成的DES可以阻碍蛋白质结构的波动。在长时间水解后(36 h),DES-5具有最好的橄榄苦苷酶水解效率,这表明基于甜菜碱与1,4-丁二醇组成的DES能长时间保持纤维素酶的稳定性,促进了橄榄苦苷的酶水解效率[18]。

2.3 不同浓度的DES对橄榄苦苷酶水解率的影响

DES的高粘度是DES作为溶剂十分重要的物理性质,因为高粘度会影响催化转化过程中酶与底物之间的传质[19]。大多数DES的粘度较高,通常向DES中加入水来克服这一问题[20]。寻找合适的DES浓度对酶促反应极为重要。因此,我们讨论了不同浓度的DES对橄榄苦苷酶水解率的影响。

由图8可知,20%和30%DES-1的酶水解率低于缓冲液,而10%DES-1的酶水解率高于缓冲液。这说明20%和30%的DES-1对酶水解反应具有一定的抑制作用。而10%的DES-1对酶水解反应具有一定的促进作用。这可能是因为水含量的增高,降低了DES-1的粘度,增加了纤维素酶与橄榄苦苷提取物之间的传质作用[21]。

图8 不同浓度DES对橄榄苦苷酶水解率的影响

在含有酶、水和非水溶剂的溶剂系统中,混合物中水分子将分布在酶的表面而形成酶的结合水,或分布在溶剂相中成为自由水[22]。而这两个区域的水分子在酶的表面时刻进行着水分子的交换。为了维持酶的活性,就需要满足存在一定量的结合水来维持酶的活性[23]。当DES浓度过大时,一方面,高浓度DES会在酶表面形成氢键网络,阻碍底物与酶的中心位点结合[24];另一方面,高浓度DES会与酶竞争结合水,使维持酶活性的结合水减少,降低酶的活性[25]。

由图8可以看出,在10%DES-1溶剂系统下,随着时间的推移其促进酶水解的效果更加显著。这也表示,随着反应时间的延长,缓冲液中纤维素酶的活力下降速率远快于10%DES-1中的下降速率。因此,10%DES-1能促进纤维素酶水解橄榄苦苷的原因之一是低浓度的DES可以促进纤维素酶的稳定性[18]。

2.4 DES单组分对橄榄苦苷酶水解率的影响

过量的水会导致HBA与HBD之间强的氢键作用逐渐衰弱,最终DES组分之间的氢键相互作用完全消失[26]。Varriale等[15]通过计算不同浓度下DES组分之间的吉布斯自由能,证明了10%～20%(V/V)DES在缓冲液中其HBA和HBD是以分离的形式存在的。然而,也有许多报道证明了10%～20%(V/V)DES相比于其单个组分更有利于维持缓冲液中对酶的稳定性[17]。为了研究NADES和纤维素酶之间的相互作用,本研究通过DES-1讨论了单个组分对酶水解率的影响。由图9可以看出,DES单组分在缓冲液中对酶水解率有一定的提升,但是只有在10%DES-1的情况下,酶水解效率获得了最高的增益。因此,这也证明了DES中的HBA和HBD对促进酶水解率不是单个组分的单独作用,而是HBA和HBD之间的联合作用来促进酶水解率。

图9 DES单组分对橄榄苦苷酶水解率的影响

3 结论

本研究通过在缓冲液中加入不同种类和浓度的NADES,研究NADES对橄榄苦苷酶水解率的影响。结果发现选择合适的种类和浓度的NADES,可以增加纤维素酶的稳定性,促进橄榄苦苷酶水解。在温度为50 ℃,pH=5的条件下水解3 h,10%DES-5(V/V)为溶剂系统的橄榄苦苷酶水解率是缓冲液的1.7倍;水解36 h的酶水解率是缓冲液的1.5倍;该方法在酶水解条件温和、高效和环保等优点的基础上,使纤维素酶长时间高效水解橄榄苦苷成为可能。本研究以氯化胆碱或甜菜碱为HBA,多元醇为HBD的NADES对增强纤维素酶稳定性,促进橄榄苦苷酶水解具有良好的效果,为高效制备橄榄苦苷酶水解产物提供科学依据。