不同AM真菌处理滇重楼中9种核苷和碱基含量分析

张兰胜，郭冬琴，黄小兰，周浓*

（1.丽江师范高等专科学校 应用技术学院，云南 丽江 674199；2.重庆三峡学院 生物与食品工程学院，重庆 404120）

滇重楼为百合科（Liliaceae）植物云南重楼［Paris polyphyllaSmith var.Yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.］的干燥根茎，被《中国药典》（2020年版）收载为中药重楼的原植物之一，为常用清热解毒药，是西南地区占据产业化利用主导地位的著名中药材［1-2］。现代研究表明，重楼具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、止血、镇痛、抗菌、抗炎等生物活性［3］。因滇重楼具有显著的生物活性，需求量不断增加，导致野生资源急剧减少，已被列为国家重点保护二级濒危药用植物［4］。只有通过栽培生产才能有效解决市场供需矛盾，实现滇重楼的可持续利用。

丛枝菌根（Arbuscular mycorrhizal， AM）是一类广泛分布在陆地生态系统中的重要土壤微生物，能够与绝大多数高等植物根系形成共生体系［5］。滇重楼是典型的丛枝菌根植物，AM真菌侵染到滇重楼根部形成椭圆形泡囊，还将菌丝伸延到土壤中去，从而扩大了吸收面，帮助滇重楼吸收P、K、S、Ca、Zn、Fe、Cu等营养元素及水分，使滇重楼的产量和品质得到提高。核苷类成分具有显著的生物活性，其对机体的心血管系统、代谢系统、免疫系统及神经系统等有着很强的调节作用，能改善人类健康和预防疾病，其含量的高低直接关系滇重楼的生物活性，是滇重楼药材的重要质量评价指标之一［6-7］。本实验对不同AM真菌处理条件下滇重楼根茎中核苷和碱基含量进行对比研究，为筛选滇重楼优良AM真菌菌株提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

通过美国国际丛枝菌根真菌种质资源保藏中心（INVAM）购得相应AM真菌纯净菌剂，接种菌剂为带有孢子、菌丝及侵染后根段的栽培基质，见表1。

滇重楼新鲜根茎取自云南省大理州农业科学推广研究院种植基地，为同一批、大小基本一致。经重庆三峡学院生物与食品工程学院周浓教授鉴定为百合科植物云南重楼的新鲜根茎。

1.2 仪器和试剂

高效液相色谱仪（LC-20A，日本岛津公司），电热恒温真空干燥仪（DZF-6050MBE，上海博讯实业有限公司），超声波清洗机（SB-5200DTN，宁波新芝生物科技股份有限公司），多管架自动平衡离心机（TDZ5-WS，湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司），分析天平（CP225D，德国赛多利斯集团）。

尿嘧啶（批号：100649-200401），鸟嘌呤（批号：140631-201205），腺嘌呤（批号：110886-200001），尿苷（批号：110887-200202），胸苷（批号：101215-201401），腺苷（批号：110879-200202）均购自中国食品药品检定研究院，纯度 ≥ 98%。胞苷（批号：1806170053），鸟苷（批号：1806170064），2′-脱氧腺苷（批号：1803260071）均购自南京都莱生物技术有限公司，纯度 ≥ 98%。水为自制超纯水，甲醇为色谱纯。

1.3 方法

1.3.1 接种处理及栽培管理

参照张海珠等［8］的实验方法，采用室温盆栽方法，共29种处理，设28个接种不同AM真菌（AM）组和1个对照（CK）组，每组6个平行。

1.3.2 样品采集

2019年11月12日，选取经过不同AM真菌处理，倒苗后的滇重楼根茎，参照韩冰洋等［9］的方法采集样品，须根临时固定于FAA液中备用。

1.3.3 菌根侵染率的测定

2020年8月10日，每组随机选取固定于FAA液中滇重楼根系30条，采用Philips和Hayman［10］的方法染色、制片、镜检，根据Gianinazzi-Pearson和Gianinazzi［11］的方法统计菌根侵染率。

1.3.4 对照品溶液的制备

分别精密称取减压干燥至恒重的尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2'-脱氧腺苷对照品适量，加纯净水溶解并制成质量浓度分别为0.520、0.520、0.600、0.636、0.618、0.486、0.648、0.572、0.510 mg/mL的对照品贮备液。

1.3.5 供试品溶液的制备

精密称取滇重楼粉末（过50目筛）1.0 g，精密称定后，按照《中国药典》一部［1］的方法，制备供试品溶液，即得。

1.3.6 色谱条件

色谱柱：Venusil MP C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；体积流量：1.0 mL/min；检测波长：260 nm；柱温：35℃；进样量：20 µL；流动相为甲醇（A）-水（B），梯度洗脱系统（0 ～ 10 min，1% ～ 5% A；10 ～ 15 min，5% ～ 15% A；15 ～ 20 min，15% ～ 20% A；20 ～30 min，20% ～ 30% A；30 ～ 40 min，30% ～ 40% A；40 ～ 50 min，40% ～ 50% A）。

1.3.7 样品含量测定

按供试品溶液的制备方法制备29批供试品溶液，平行3份，按HPLC条件测定峰面积，以外标两点法计算各滇重楼中9种核苷和碱基的含量。

1.3.8 数据分析

采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析和相关性分析，LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 AM对滇重楼根系菌根侵染率的影响

AM侵染植物根系后可以扩大根系在土壤中的有效吸收范围，促进植物生长发育和物质积累［12］。由表2可以看出，28个不同AM真菌均能通过形成丛枝菌根结构侵染滇重楼根系，但各处理组之间有较大的侵染强度差异。同时，对照（CK）组也形成了菌根结构，说明滇重楼根系在接种AM真菌前就已经被侵染，与周浓等人的研究结果一致［13］。Ga、Gd、Gr、Sca、Spe、Rco、Rfu、Sde、Svi、Fm、Cc、Rcl、Afo、Asc、Asp、De、Ds、Ec、Pb、Po、Ale、Atr处理组的侵染率均比CK组增强，其中Ga、Asc和Asp处理组的侵染率增强最明显，分别达到96.50%、95.45%和94.80%，与CK组（71.80%）相比提高了24.70%、23.65%和23.00%。由此可见，外源AM真菌对滇重楼根内AM真菌的侵染率具有调控作用。

表2 接种不同AM真菌对滇重楼根系菌根侵染率的影响Tab.2 The effects of inoculation of different AM fungi on infection rates of root system of Paris polyphylla var. yunnanensis

2.2 丛枝菌根对滇重楼根茎中核苷含量的影响

丛枝菌根对滇重楼根茎中核苷含量的影响结果见图1。经方法学考察，精密度、重复性、稳定性、线性关系等均符合含量测定要求。

图1 混合对照品（A）及样品（B）的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of Paris polyphylla var. yunnanensis mixed reference substances （A） and sample （B）

28种不同AM真菌处理组均能影响滇重楼中9种核苷和碱基的含量，见表3。Gd、Gg、Gm、Sca、Sdi、Spe、Dh、Rfu、Sde、Svi、Fm、Rcl、Rin、Afo、Asp、De、Pb和Po处理组与CK组比较核苷和碱基的总含量增加，其中De、Po和Sde处理组增加显著，分别增加了68.68%、67.84%和52.90%，增加率均在50%以上。滇重楼中9种核苷和碱基的含量测定结果显示，尿嘧啶在Cc处理组中含量最高，达到123.882 μg/g，与CK组有显著性差异，在Rin处理组中含量最低（2.970 μg/g）；胞苷在Sde处理组中含量最高，达到109.388 μg/g，在Ga处理组中含量最低（12.640 μg/g）；鸟嘌呤在Cc处理组中含量最高，达到180.338 μg/g，在Ga处理组中含量最低（20.620 μg/g）；尿苷在Sde处理组中含量最高，达到145.494 μg/g，在Cc处理组中含量最低（47.208 μg/g）；腺嘌呤在De处理组中含量最高，达到43.741 μg/g，在Rco处理组中含量最低（1.982 μg/g），与CK组有显著性差异；鸟苷在De处理组中含量最高，达到89.831 μg/g，在Gr处理组中含量最低（5.905 μg/g）；胸苷在Gd处理组中含量最高，达到125.844 μg/g，在Ale处理组中含量最低（32.465 μg/g）；腺苷在Gd处理组中含量最高，达到207.061 μg/g，在Rco处理组中含量最低（5.354 μg/g），与CK组有显著性差异；2'-脱氧腺苷在De处理组中含量最高，达到148.734 μg/g，在Rco处理组中含量最低（4.289 μg/g）。说明AM真菌对滇重楼根茎中核苷和碱基的含量有影响。

表3 不同AM真菌处理滇重楼根茎中9 种成分的含量Tab. 3 The contents of nine components in Paris polyphylla var. yunnanensis treated with different AM fungi μg/g

2.3 相关性分析

不同AM真菌处理滇重楼菌根侵染率与根茎中9种成分相关性分析见表4。从表4可知，滇重楼菌根侵染率与滇重楼根茎中核苷和碱基的含量之间有一定的相关性。菌根侵染率与尿嘧啶、胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷和2'-脱氧腺苷呈负相关，尤其与胸苷呈显著的负相关（r= -0.390），与鸟嘌呤和腺苷呈正相关。因此，增强菌根侵染率可以促进滇重楼根茎中鸟嘌呤和腺苷含量的提高，但是增强菌根侵染率反而对滇重楼根茎中尿嘧啶、胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷和2'-脱氧腺苷的含量有降低作用。

表4 不同AM真菌处理滇重楼菌根侵染率与根茎中9种成分相关性分析Tab.4 The correlation analysis of the mycorrhizal infection rate and the nine components in Paris polyphylla var. yunnanensis treated with different AM fungi

滇重楼根茎中核苷和碱基之间也有一定的相关性，尿嘧啶与鸟嘌呤呈极显著的正相关（r=0.774），与尿苷和腺苷呈极显著的负相关（r=-0.494、-0.541）；胞苷与腺嘌呤、胸苷和2'-脱氧腺苷呈极显著的正相关（r= 0.725、0.615、0.656），与鸟苷呈显著的正相关（r= 0.382）；鸟嘌呤与腺苷呈极显著的负相关（r= -0.513）；腺嘌呤与鸟苷、胸苷和2'-脱氧腺苷呈极显著的正相关（r= 0.481、0.653、0.823），与腺苷呈显著的正相关（r= 0.412）；鸟苷与2'-脱氧腺苷呈极显著的正相关（r= 0.628），与腺苷呈显著的正相关（r= 0.441）；胸苷与2'-脱氧腺苷呈极显著的正相关（r= 0.696）；腺苷与2'-脱氧腺苷呈极显著的正相关（r= 0.676）。

3 讨论和结论

AM真菌能促进宿主植物吸收营养元素和水分，增强植物的抗病抗逆能力，稳定土壤结构，调节植物土壤关系等，在生态系统物质循环中占有重要地位［14］。AM真菌通过特异性调控宿主植物体内抗逆相关基因的表达，从而改变宿主植物的生理生化特征以及对外界环境的适应能力［15］。近年来，分子生物学技术得到快速发展，交叉到各学科中被广泛应用，对AM真菌的研究也不断深入，尤其在AM真菌的检测鉴定和与宿主植物共生互作等方面取得了丰硕成果，推动了菌根学的形成。但与其他学科相比，菌根学的研究还亟待进一步推进。当前，AM真菌的研究应有效利用形态学、生物学及现代分子生物技术，使得分类方法更加科学合理；应加强生物学、生态学与分子生物学技术的结合，解析AM真菌功能多样性。

滇重楼因其显著的疗效，越来越被广泛使用，目前已出现严重的资源紧缺现象［16］，主要通过人工种植提供原料。但在种植中存在繁殖效率低、生长缓慢、病虫害严重、栽培技术不成熟等突出问题［17-18］，严重威胁到以其为原料的医药工业的生存与发展。因此，通过发展滇重楼栽培技术，实现栽培技术现代化，达到提高滇重楼产量和质量的双重目标，是药用植物栽培工作者的当务之急和热点问题。滇重楼是典型的丛枝菌根植物，滇重楼与AM真菌共生可以促进滇重楼对营养元素和水分的吸收，改善滇重楼的营养状况，提高抗病抗逆能力，修复受损根系，优化土壤结构，使滇重楼的产量和品质都得到提高［19-21］。

本实验结果表明，28个不同AM真菌均能通过形成丛枝菌根结构侵染滇重楼根系，其中Ga、Gr、Rcl、Asc和Asp处理组的侵染率均达到90%以上，Gg、Gm、Sdi、Rin和Ako处理组虽然能侵染滇重楼根系，但是侵染率较低。由此可见，外源AM真菌能有效促进滇重楼的生长发育、扩大成品产量。同时表明，因滇重楼对AM真菌存在选择特异性，在种植栽培过程中需要选择性的施加AM菌剂，形成良好的互惠关系，促进产量和品质双丰收。

28种不同AM真菌处理组均能影响滇重楼中9种核苷和碱基的含量，不同AM真菌对滇重楼中核苷和碱基含量表现出不同的变化规律，与CK组比较De、Po和Sde处理组能显著增加核苷和碱基的总含量，增加率均在50%以上。相反，Rco和Asc处理组显著减少了滇重楼中核苷和碱基的总含量。不同核苷和碱基在不同AM真菌处理下，在滇重楼中的含量变化规律差异较大，比如尿嘧啶在Cc处理组中含量最高，与CK组相比增加了24倍，但在Rin处理组中含量仅为CK组的一半；鸟苷在De处理组中含量最高，与CK组相比增加了5.8倍，但在Gr处理组中含量仅为CK组的1/3。进一步表明，AM真菌对滇重楼中核苷和碱基的含量具有调控作用，其共生关系具有一定的适应性和选择性［22］。

菌根侵染率与胸苷呈显著的负相关，与鸟嘌呤和腺苷呈正相关，表明滇重楼菌根侵染率与根茎中核苷和碱基的含量之间有一定的相关性，协同和拮抗作用同时存在，在种植栽培滇重楼过程中，追求数量的同时要兼顾质量。滇重楼根茎中核苷和碱基之间也有一定的相关性，有些成分之间能有效促进彼此含量的提升，但也有部分成分之间存在相互抑制。比如腺嘌呤含量增加的同时，胞苷、鸟苷、胸苷、腺苷和2'-脱氧腺苷的含量也得到显著提高。相反，尿嘧啶却能显著抑制尿苷和腺苷含量的提高。说明滇重楼根茎中核苷和碱基的积累可能同时存在协同和竞争两种效应。

综上所述，在种植栽培滇重楼过程中可接种Sde、Gd、Sca、Spe、Svi、Pb几种AM真菌，联合使用多种AM真菌，有望增加滇重楼的产量，提升药材品质。本研究中菌根侵染率与滇重楼核苷和碱基含量没有显著的相关性，可能是由于观察年限不够，滇重楼属于多年生药用植物，其成分积累是一个漫长的过程。下一步应结合生物学、生态学与分子生物学等技术，系统研究“滇重楼-AM真菌-侵染率-核苷和碱基含量”不同单元间同时存在的协同和竞争两种效应的内在规律性，探讨AM真菌对滇重楼产量和品质影响的过程、机制和物质基础，为滇重楼的种植栽培提供科学依据。