25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮对鸡蛋壳质量及钙代谢的影响

2024-02-26程千惠汪智云王焕斌黄竹林伍志敏齐德生

饲料工业 2024年2期

■ 程千惠汪智云王焕斌黄竹林陈橙伍志敏齐德生*

（1.华中农业大学动物科学技术学院，湖北武汉 430070；2.武汉民族生物科技有限公司，湖北武汉 430064；3.武汉市动物疫病预防控制中心，湖北武汉 430014）

在规模化蛋鸡养殖模式下，破蛋率高、蛋壳质量差给蛋鸡养殖业带来很大损失[1-2]。因此，研究如何提高蛋壳质量，对蛋鸡生产有重要的理论意义和实践价值。有研究表明，导致破蛋率高、蛋壳质量差的主要原因有：光照强度不足导致内源性维生素D3合成变少，从而使肠道钙吸收减少[3]；养殖过程中出现的各种氧化应激情况，使钙吸收和钙转运出现问题[4-5]；养殖业为提高产蛋率而延长养殖周期，导致蛋鸡在后期体内雌激素水平下降，使蛋壳钙化和骨代谢出现紊乱，从而导致蛋壳质量下降[6]。25-羟维生素D3提高维生素D 状态的相对有效性是维生素D3的3.13～7.14 倍，其能有效地刺激肠道对钙离子的吸收[7]。维生素C 作为一种重要的抗氧化剂，被证明可以减少氧化应激[8-9]；大豆异黄酮是一类植物类雌激素，可提高机体内雌激素水平[10-11]。本试验在蛋鸡饲粮中添加不同浓度的25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮，通过分析蛋鸡生产性能、蛋壳质量、血清抗氧化指标以及十二指肠和肾脏等部位与钙吸收有关的基因，初步探讨25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮等物质对蛋鸡蛋壳质量的影响及其可能的生物学机制，以期为研制有关饲料添加剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验采用三因素三水平的正交试验，选取972 只50 周龄体况基本一致的京粉一号蛋鸡（初始体重约1.78 kg），随机分为9组，每组6个重复，每个重复18只，预试期1 周，正试期6 周。基础饲粮组成及营养水平见表1。试验饲粮为在基础饲粮中分别添加0、10、20 µg/kg 25-羟维生素D3，0、50、100 mg/kg 维生素C，0、5、10 mg/kg 大豆异黄酮配制而成。具体试验分组见表2。试验蛋鸡采用三层阶梯式笼养，每天喂料两次，保证蛋鸡自由采食，充足饮水。光照强度为10～15 Lx，舍内温度为24～28 ℃，饲养期间，蛋鸡日常管理参考蛋鸡饲养管理技术。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

表2 试验分组

1.2 样品采集

在正式期第2、4、6 周结束时，每个处理组随机采集18 枚鸡蛋（每个重复3 枚）总计162 枚鸡蛋，进行蛋壳质量和蛋品质测定。每个重复随机选取1 只鸡，在自由饮水条件下禁食12 h，采用颈动脉采血法采血，血液采集后，室温静置0.5 h后置于冰盒后转至4 ℃冰箱过夜，次日3 500 r/min 离心10 min 收集上层血清，-80 ℃保存。蛋鸡处死后采集子宫、卵巢、肾脏和十二指肠样品于-80 ℃冰箱保存。剥离蛋鸡左胫骨于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 测定指标

1.3.1 生产性能的测定

记录每天饲料添加量、每周末的饲料剩余量以及产蛋量和蛋重（以重复读为单位），每两周计算平均蛋重、平均日采食量、产蛋率及料蛋比。

平均蛋重（g）=总产蛋重量/总产蛋数

平均日采食量（g）=总采食量/（试验天数×鸡只数）

产蛋率（%）=总产蛋数/（试验天数×鸡只数）×100

料蛋比=总采食量/总蛋重量

1.3.2 蛋品质的测定

将鸡蛋置于蛋品质测定仪进行测定（EMT-5200型多功能蛋品检测仪，日本robotmation 股份有限公司），测定指标包括蛋重、蛋黄颜色和哈氏单位。用游标卡尺测定鸡蛋中轴处的直径为横径，两端的距离为纵径，蛋形指数=蛋的纵径长/蛋的横径长。

1.3.3 蛋壳质量的测定

蛋壳强度使用蛋壳强度测定仪进行测定（EFG-0503型蛋壳强度测定仪，日本robotmation 股份有限公司）。蛋壳厚度：分别取蛋的大头、小头和中间部分的蛋壳，用镊子剔除内壳膜，并使用螺旋测微器分贝测量其厚度，再将三点的值平均，即为蛋壳的厚度。

1.3.4 胫骨及蛋壳中钙磷含量测定

钙磷含量分别按《GB/T 6436—2018》《GB/T 6437—2018》测定，结果分别以脱脂烘干重、蛋壳风干重为基础表示。

1.3.5 血清生化指标测定

使用试剂盒测定血钙和雌二醇（购于南京建成生物工程研究所有限公司）、1,25-双羟维生素D3（购于南京卡米洛生物工程有限公司），具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.3.6 血清抗氧化指标测定

使用试剂盒测定丙二醛（MDA）含量、过氧化物酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力及总抗氧化能力（T-AOC）。试剂盒购于南京建成生物工程研究所有限公司，操作按说明书进行。

1.3.7 mRNA相对表达量的测定

将冷冻样品于研钵中加液氮研磨，称取0.05 g 样品于预冷1.5 mL RNase-Free EP 管中，并加入1 mL Trizol，提取总RNA。调平RNA 浓度至1 000 ng/µL，去除基因组DNA。反转录反应程序为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，得到的cDNA，稀释10 倍后保存于-80 ℃冰箱。以β-actin为内参基因，荧光定量PCR 反应使用10 µL体系：4.0 µL cDNA，5.0 µL SYBR Premix，0.3 µL上游引物，0.3 µL 下游引物，0.4 µL DEPC 水。用Bioa-Rad CFX 384 实时荧光定量PCR 检测仪（美国BIO-Rad）检测，反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环40次；72 ℃延伸5 min。试验所用基因引物由Primer Pre‐mier 5.0 软件设计，由北京擎科新业生物技术有限公司合成，引物序列见表3。

表3 PCR反应的引物序列

1.4 数据的统计与分析

通过SPSS 19 进行分析，主效应分析使用极差法进行，简单效应方差分析（三元线性样本回归模型为：使用多元线性样本回归模型进行，使用Duncan’s 检验进行多重比较，结果表示为“平均值±标准差”，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 生产性能

由表4 知，前两周，与0 添加量相比，添加不同水平的25-羟维生素D3可显著增加平均蛋重（P＜0.05），添加不同水平的大豆异黄酮可显著降低平均蛋重（P＜0.05）。与0 添加量相比，添加20 µg/kg 25-羟维生素D3在第4 周末可显著增加平均蛋重（P＜0.05），添加5 mg/kg 大豆异黄酮可显著提高产蛋率、降低平均蛋重（P＜0.05）。与0 添加量相比，添加20 µg/kg 25-羟维生素D3可显著增加第6 周平均蛋重（P＜0.05），添加5 mg/kg 大豆异黄酮可显著提高产蛋率、降低平均蛋重（P＜0.05）。

表4 25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮对生产性能的影响（n=6）

2.2 蛋品质

由表5知，添加不同水平的25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮对蛋黄颜色、蛋白高度、哈氏单位及蛋形指数均无显著影响（P＞0.05）。

表5 25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮对蛋品质的影响（n=6）

2.3 蛋壳质量及主效应分析

由表6 知，与0 添加量相比，添加10 µg/kg 25-羟维生素D3，50、100 mg/kg 维生素C，5、10 mg/kg 大豆异黄酮均可显著增加第6 周末蛋壳强度和蛋壳厚度（P＜0.05），与0添加量相比，添加20 µg/kg 25-羟维生素D3可在整个试验期显著增加蛋壳强度及蛋壳厚度（P＜0.05）。

表6 25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮对蛋壳质量的影响（n=6）

以蛋壳强度为评价指标的主效应分析见表7。在整个试验期最佳组合为20 µg/kg 25-羟维生素D3、50 mg/kg 维生素C和5 mg/kg 大豆异黄酮。

表7 25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮对蛋壳强度主效应分析（n=6）

2.4 血清生化指标

由表8 可知，雌二醇含量随着大豆异黄酮添加水平的增加而显著提高（P＜0.05）。与0 添加量相比，添加20 µg/kg 25-羟维生素D3，50 mg/kg 维生素C，5、10 mg/kg 大豆异黄酮均可显著提高血清中1,25-双羟维生素D3含量（P＜0.05）。

表8 25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮对血清生化指标的影响（n=6）

2.5 血清抗氧化指标

由表9可知，与0添加量相比，添加20 µg/kg 25-羟维生素D3可显著增加MDA 水平（P＜0.05），添加50、100 mg/kg 维生素C 可显著提高CAT 水平（P＜0.05），显著降低MDA 水平（P＜0.05），添加5、10 mg/kg 大豆异黄酮均可显著提高CAT、GSH-Px 水平（P＜0.05），显著降低MDA水平（P＜0.05）。

表9 25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮对血清抗氧化能力的影响（n=6）

2.6 骨骼及蛋壳钙磷沉积

由表10 可知，与0 添加量相比，添加20 µg/kg 25-羟维生素D3可显著提高蛋壳钙含量（P＜0.05），添加50 mg/kg 维生素C 及5 mg/kg大豆异黄酮可显著提高胫骨钙含量（P＜0.05）。

表10 25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮对骨骼及蛋壳钙磷沉积的影响（n=6）

2.7 钙转运相关基因的mRNA表达量

由图1 可知，与0 添加量相比，添加10、20 µg/kg 25-羟维生素D3均可显著提高十二指肠中CaBPD28k、VDR及肾脏CYP27B1表达量（P＜0.05），且当25-羟维生素D3添加量为20 µg/kg 时可显著增加肾脏中CaBP-D28k表达量（P＜0.05）。与0添加量相比，添加50、100 mg/kg 维生素C 可显著提高十二指肠CaBP-D28k、肾脏CYP27B1表达量（P＜0.05）。添加5 mg/kg 大豆异黄酮可显著提高子宫中ERα、CA2表达量（P＜0.05）。

图1 25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮对钙转运相关基因的影响

3 讨论

3.1 25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮对蛋鸡生产性能的影响

试验发现在饲粮中添加25-羟维生素D3对采食量、产蛋率、料蛋比无影响，但可增加平均蛋重。Kes‐havarz 等[12]研究发现饲粮中添加69 µg/kg 25-羟维生素D3对蛋鸡生产性能无影响。有研究发现产蛋高峰期血液中25-羟维生素D3水平显著高于产蛋后期[3]，这说明在蛋鸡不同日龄添加25-羟维生素D3的影响不同，这可能也是本试验与Keshavarz 等[12]研究结果差异的原因。

蛋禽生产中，多采用维生素C 来改善应激情况下蛋鸡的生产性能。Seven[13]发现，当蛋鸡处于热应激状态时，添加200 mg/kg 的维生素C 能显著提高其产蛋率，但剂量增加至400 mg/kg 时对产蛋率无影响。本试验研究发现与添加量相比，当维生素C 的添加量为50 mg/kg 时可显著提高产蛋率，但添加量为100 mg/kg 时对产蛋率无影响。这可能是因为蛋鸡处于不同环境温度时，维生素C 的最佳添加浓度不同。本试验蛋鸡所处环境为25～28 ℃恒温环境，而Seven[13]试验是在热应激条件下进行的。

王红琴等[14]发现大豆异黄酮能显著提高产蛋后期蛋鸡的产蛋率，降低料蛋比。此外，也有研究发现黄酮类物质可提高机体甲状腺激素T3、T4 水平，可促进体内营养物质代谢吸收，从而提高生产性能[15]。本试验结果发现添加5 mg/kg 大豆异黄酮可提高蛋鸡产蛋率与前人研究结果类似。

综上，在基础日粮中添加25-羟维生素D3可以提高产蛋后期平均蛋重；添加适量维生素C 可提高产蛋率，但添加量过高对产蛋率无影响，且最适添加浓度因环境条件不同而异；添加大豆异黄酮可提高蛋鸡产蛋率。

3.2 25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮对蛋壳质量的影响

Navickis 等[16]研究发现，适宜的维生素D3可以增加蛋壳钙含量和蛋壳厚度。康乐等[17]发现添加维生素D3能显著提高蛋壳强度和蛋壳厚度。本试验结果发现，第2～6 周时添加20 µg/kg 的25-羟维生素D3可显著增加蛋壳强度、蛋壳厚度。

有研究表明在热应激条件下，添加200 mg/kg、400 mg/kg 维生素C 可显著提高蛋壳质量，降低破蛋发生率[18]。本试验发现50、100 mg/kg 维生素C 均可改善蛋壳质量。

有研究发现补充大豆异黄酮可以改善肠道钙吸收，从而提高骨形成和蛋壳质量[19-21]。本试验研究发现大豆异黄酮可提高蛋壳厚度和蛋壳强度。

综上，添加25-羟维生素D3可提高蛋壳厚度及蛋壳强度，从而增强蛋壳质量。维生素C 可通过缓解环境应激，从而增强蛋壳质量。大豆异黄酮可增加钙的吸收和沉积，从而增强蛋壳质量。

3.3 25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮对抗氧化指标的影响

25-羟维生素D3的体内合成底物7-脱氢胆固醇是最易氧化的脂质之一，7-脱氢胆固醇过多会引起细胞膜脂质过氧化[22-23]。本试验研究发现添加25-羟维生素D3能提高CAT、T-AOC 和GSH-Px 水平，当添加水平为20 µg/kg 时显著提高MDA 水平。25-羟维生素D3是否通过影响7-脱氢胆固醇从而降低机体过氧化，有待进一步研究。

诸多研究均验证了维生素C可提高畜禽抗氧化能力[24-27]。本试验结果发现维生素C添加量为100 mg/kg时，血清中SOD 含量显著降低。这说明维生素C 作用不一致可能与动物的不同阶段和维生素C 的补充水平有关。

Shimoda 等[28]研究发现大豆异黄酮可以终止自由基的连锁反应、清除自由基，能够提高机体抗氧化能力。Ni 等[29]研究发现添加5、10 mg/kg 大豆异黄酮可提高蛋鸡肝脏GSH-Px 活性，降低血清中MDA 水平。本研究结果发现5 mg/kg 大豆异黄酮显著提高血清中CAT、GSH-Px水平，降低MDA水平。

综上，25-羟维生素D3可显著提高MDA 水平，但具体机制有待进一步研究。维生素C 可通过促进维生素E 的重生从而提高机体抗氧化水平，而高浓度维生素C 促进氧化。在饲粮中添加低水平的大豆异黄酮可提高CAT、GSH-Px 水平，降低MDA 水平，提高机体抗氧化能力。

3.4 25-羟维生素D3、维生素C、大豆异黄酮影响钙吸收代谢的生物学机制

蛋壳中的钙主要来源于小肠中的钙吸收，特别是十二指肠[30]，钙的转运途径由维生素D3驱动，维生素D3及其受体对钙的吸收起着重要作用[31]。有研究表明，在维生素D3缺乏的情况下补充25-羟维生素D3能增加小肠和肾脏中CaBP-D28K的表达[32]。本试验结果发现，添加25-羟维生素D3可显著提高十二指肠CaBP-D28K、VDR水平，可显著提高蛋壳中钙沉积，对胫骨中钙沉积有提高趋势。

在大多数动物研究中，维生素C 可以通过促进成骨细胞的增殖和分化以及在添加促氧化物质时增强其抗氧化功能而加速骨形成[33-34]。本试验结果发现，添加维生素C 可增加胫骨中钙的含量，说明维生素C可能在促进成骨细胞生成中起着重要的作用。

Quesada 等[35]研究发现大豆异黄酮可以作为雌激素激动剂调控雌激素受体ERα和ERβ影响钙离子释放通路，从而影响髓质骨的形成和蛋壳的钙沉积。Holm 等[36]研究表明注射雌激素可提高蛋壳腺CA2活性，从而增强蛋壳质量。Kajiya 等[37]有研究表明大豆异黄酮对骨代谢具有刺激作用，可以增加骨矿物质含量，有助于钙沉积，提高蛋壳质量。本研究发现大豆异黄酮作为一种植物性的类雌激素，可提高机体雌二醇水平，促进子宫钙沉积基因ERα、CA2表达，并显著提高胫骨钙沉积量和蛋壳质量。

综上，25-羟维生素D3通过促进十二指肠和肾脏中CaBP-D28k基因的表达，促进机体钙吸收以及蛋壳钙沉积。维生素C 通过提高肾脏CYP27B1水平，从而促进肠道钙吸收和胫骨钙沉积。大豆异黄酮可促进髓质骨的形成，提高胫骨Ca 含量，促进子宫中ERα和CA2表达，有利于子宫中钙代谢。