贝莱斯芽孢杆菌对金霉素作用下肉鸡生长性能、肠道菌群及其耐药基因的影响研究

■ 张义楠 闫 雪 赵 晨 田向学 董志民 李富强 王素英 李秀丽*

（1.天津市农业科学院畜牧兽医研究所，天津 300381；2.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134；3.新希望六和股份有限公司，农业农村部饲料及畜禽产品质量安全控制重点实验室，四川成都 610023；4.国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037）

饲用抗生素的使用促进了畜牧养殖业的快速发展，但其长期滥用也导致了细菌耐药性增强、耐药基因（antibiotic resistance genes, ARGs）广泛传播、药物残留及食品安全等问题日益严重[1-2]。随着全面禁抗的到来，寻找有效的抗生素替代品是亟待解决的问题。目前研究较多的抗生素替代品为益生菌、益生元和合生元等微生态制剂、酸化剂、植物提取物、中草药添加剂和酶制剂等。已有研究表明，这些抗生素替代品在养殖业中能达到提高饲料转化率、调节肠道菌群稳态、增强机体免疫力等目的[3-6]，但也存在各自的优缺点。其中益生菌具有绿色、无污染、不易产生耐药性且在动物生产中效果显著等特点，是抗生素的理想替代品之一。贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）是芽孢杆菌属的一个新种，与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensi）极其相似，被归为一个工作组，即“Operational GroupB.amyloliquefaciens”[7]。贝莱斯芽孢杆菌广泛存在于自然界中，易于分离和培养，且对人和动物无害、不污染环境。研究表明贝莱斯芽孢杆菌具有抗逆性强、抑菌谱广、可产多种酶类及抑菌活性物质等益生特性，是潜在的益生菌[8-11]。

近年来，国内外大量研究表明，抗生素的使用不仅导致肠道菌群的组成和丰度发生变化，也对ARGs的种类和丰度有重大影响。如Pi 等[12]给仔猪饲喂氨苄西林、庆大霉素和甲硝唑混合物后发现抗生素显著改变了回肠和粪便中的微生物组成，Bifidobacterium、Lactobacillus和Ruminococcus的 数 量 减 少，而Esch⁃erichia coli的丰度增加。此外，肠道菌群是耐药基因转移和储存的场所，肠道菌群内ARGs 的富集使菌群的组成和丰度发生变化，特别是致病菌和条件致病菌数量增多，对畜禽和人体健康构成威胁[13-14]。目前已有研究表明益生菌的使用既可促进机体生长发育，也可治疗或预防由抗生素导致的肠道菌群紊乱[15]。此外，一些研究发现益生菌具有调节ARGs 的作用。如Lin 等[16]试验研究在25.0 mg/kg 阿莫西林作用后益生菌对小鼠肠道菌群和耐药基因的调节作用，结果表明益生菌（长双歧杆菌）能通过诱导特定菌群（益生菌的增加）变化并清除特定耐药基因来到达调节目的。Esaiassen 等[17]探讨了益生菌补充剂（嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌婴儿亚种）对挪威早产婴儿的影响，发现补充益生菌可以诱导定植抗性，减轻抗生素对早产婴儿肠道菌群和抗生素耐药基因的有害作用。Casaburi等[18]研究表明，在生命早期补充益生菌能降低耐药基因的丰度。然而目前在畜禽养殖上关于益生菌对抗生素作用后的肠道菌群和ARGs的调节研究还未见报道。

本研究使用前期从肉鸡盲肠内容物中分离的一株具有较强益生特性的贝莱斯芽孢杆菌H-7 饲喂抗生素作用后的肉鸡，评估贝莱斯芽孢杆菌对抗生素作用下肉鸡生长性能、肠道菌群和ARGs的影响，以期为该菌种的开发应用提供前期理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌种：从28 日龄健康肉鸡盲肠内容物筛选鉴定得到的贝斯芽孢杆菌H-7（Bacillus velezensisH-7）。

试验所用金霉素购自驻马店正大有限公司。

1.2 试验动物及基础日粮

本试验的所有肉鸡动物试验的程序由天津市农业科学院畜牧兽医研究所动物伦理委员会批准实施。肉鸡在生长阶段需要进行换料，均购自天津昕牧川科技有限公司西青分公司，本试验肉鸡分1～21 日龄和22～35 日龄两个阶段基础日粮喂养，基础日粮配方及营养水平见表1。

表1 不同阶段基础日粮配方及营养水平

1.3 试验设计与饲养管理

试验一：研究添加不同剂量金霉素后肉鸡盲肠菌群组成的组内及组间差异，以确定试验二中金霉素使用剂量和时间。将体重相近[（45.05±0.15） g]、健康状态良好且雌雄各半的360 羽1 日龄肉鸡随机分为4 组，每组6 个重复，每个重复15 只鸡，且公母混养，饲养至28 日龄。分别在基础日粮中添加0、50、150、250 mg/kg 金霉素，分别对应对照组（A 组）、低剂量组（B 组）、中剂量组（C 组）以及高剂量组（D 组），试验结束后采集盲肠内容物，进行宏基因组测序。

试验二：研究不同添加量Bacillus velezensisH-7对金霉素作用下肉鸡生长性能、肠道菌群和耐药基因的影响。根据试验一确定金霉素使用剂量为150 mg/kg，时间为7 d，将雌雄各半的450 羽1 日龄肉鸡[（45.25±0.91） g]分为5个试验组，每组6个重复，每个重复15只，且公母混养，按表2 的方案进行饲喂。试验期间进行生长性能指标测定，并采集盲肠内容物进行宏基因组测序。

表2 试验分组及饲喂方案

试验在天津市武清区下伍旗镇忠义村天津畜牧兽医研究所基地进行。试验前期对饲养鸡舍进行清扫、消毒。对鸡舍的供水、供暖、料槽等设备逐一排查，确保肉鸡饲养环境合格。肉鸡7 日龄之前鸡舍内温度维持在33 ℃左右，7～21 日龄时温度逐渐降低至23 ℃，21～35日龄温度维持在23 ℃左右[19]。肉鸡在试验期间自由采食和饮水，每日对鸡舍中鸡粪进行打扫，保证卫生。肉鸡的免疫程序按照常规进行，试验期间记录各组肉鸡体重和采食情况。

1.4 样品采集与指标测定

1.4.1 盲肠内容物采集

试验一于试验第7、14、21、28 天分别从4 个试验组的6 个重复中随机挑选2 只肉鸡（雌雄各一只），分别将肉鸡切断颈动脉放血处死，剖开腹腔，取出盲肠，用无菌水冲洗表面，立即用人工挤压方式获取盲肠内容物，将其放置无菌塑料管中。考虑重复组间的个体差异，将每组所有盲肠内容物均匀混合再平均分成3 个生物重复样本，其他时间点各组盲肠内容物按上述方法制成3 个生物重复样本。液氮速冻，后转移至-80 ℃保存备用。

试验二于试验第7、21、35天分别从5个试验组的6 个重复组中随机挑选2 只肉鸡（雌雄各一只），盲肠内容物取样如上述一致。

1.4.2 盲肠内容物基因组DNA提取

根据天根粪便基因组DNA 提取试剂盒（DP328）说明书进行盲肠内容物基因组DNA 提取。提取结束后利用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA的纯度和完整性，并使用Qubit 2.0 荧光计（Life Tech‐nologies,CA,USA）对DNA 的浓度进行精确定量以确保宏基因组测序文库构建能顺利进行（每份样品中DNA浓度不低于5 µg）。

1.4.3 宏基因组测序

采用Covaris 超声波破碎仪将检测合格的DNA 样品打断。随后进行末端修复、3'端加尾、加测序接头等步骤完成文库的制备。制备好的文库使用 Qubit 2.0 进行初步定量。使用 Agilent 2100 检测文库片段大小。通过实时荧光定量PCR 准确定量文库有效浓度（文库有效浓度＞3 nm）。DNA 文库构建完成后，每个样本文库均按要求通过Illumina HiSeq PE150 测序平台进行测序。

1.4.4 测序数据分析

使用Readfq（V8，https：//github.com/cjfields/readfq）对原始数据进行预处理以获得用于后续分析的clean data。依据质控后的各样品有效数据，对宏基因组数据分别进行组装，并将有效的scaftigs（≥500 bp）用于基因预测和进一步分析。利用MetaGeneMark 对组装scaftigs 进行ORF 预测，并过滤预测结果中长度小于100 nt 的信息。采用CD-HIT 软件进行去冗余，获得每个样本的gene catalogue。从gene catalogue 出发，使用DIAMOND 软件和MicroNR 数据库中细菌(Bacte‐ria)、真菌(Fungi)、古菌(Archaea)和病毒(Viruses)序列进行比对，获得每个基因（Unigene）的物种注释信息。从各个分类层级上的丰度表出发，进行相对丰度图和丰度聚类热图展示，进行PCA 和NMDS 降维分析，组间差异物种的LEfSe多元统计分析。使用抗生素耐药基因综合数据库CARD提供的Resistance Gene Identi‐fier(RGI)软件将Unigenes 与CARD 数据库进行比对。根据比对结果，计算各组的耐药基因相对丰度值，并进行丰度柱形图展示。

1.4.5 生长性能指标测定与方法

在试验二开始时先测量各组肉鸡的初始体重，随后在肉鸡21日龄和35日龄早晨对每组的各个重复进行称重，每次称重前的12 h 停止给肉鸡喂料，计算各组肉鸡的平均日增重（ADG）。在21日龄和35日龄结料称重，计算平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。平均日增重（g）=（平均末重-平均初始重）/天数平均日采食量（g）=（总投料量-剩料量）/（天数×重复数）

料重比=平均日采食量/平均日增重

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 26.0 进行生长性能数据的单因素方差分析（one-way ANOVA, LSD），P＜0.05 为差异显著，试验结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果分析

2.1 不同剂量金霉素对肉鸡肠道菌群和耐药基因的影响

2.1.1 不同剂量金霉素对肉鸡肠道菌群组成的影响

盲肠菌群的NMDS 分析和Bray-Curtis 距离构建的聚类树结果如图1、图2所示。在图1中，点与点间距离越近，物种组成结构越相似，反之物种组成差异越大。从图1 可以看出，同一处理组，7 日龄与14 日龄、21 日龄和28 日龄的距离较远，不同处理组，7 日龄之间距离也较远。从图2 中可以看出，7 日龄时各组与其他3个日龄点的各组不聚在同一分支上，与14日龄、21日龄和28日龄相比，7日龄时肉鸡盲肠菌群结构组成差异较大。与图1 的NMDS 分析结果一致。此外，在7 日龄时，中剂量组（150 mg/kg）与其他3 组不聚在同一分支中。

图1 NMDS分析

图2 基于Bray-Curtis的聚类树分析

2.1.2 不同剂量金霉素对肉鸡肠道中特定物种的影响

从图3 可以看出，7 日龄时，与对照组相比，抗生素试验组中有益菌双歧杆菌属、乳杆菌属的丰度均下降，尤其是中剂量组乳杆菌属的丰度显著下降（P＜0.05）。

图3 特定物种绝对丰度情况

7日龄时，中剂量组（150 mg/kg）肠杆菌属的丰度显著高于对照组（0 mg/kg）和低（50 mg/kg）、高（250 mg/kg）剂量组（P＜0.05），而在14 日龄、21 日龄和28 日龄时各组间差异不显著（P＞0.05）。7 日龄时，中剂量组（150 mg/kg）中肠杆菌属的丰度与对照组（0 mg/kg）无显著差异，但显著高于低（50 mg/kg）、高（250 mg/kg）剂量组（P＜0.05）。

2.1.3 不同剂量抗生素对肉鸡肠道中耐药基因的影响

使用CARD 数据库（综合抗生素研究数据库）对每个样本进行ARGs 分析，计算各组之间的ARO 丰度信息，绘制耐药基因分布Venn 图。结果如图4 所示。图4（A）显示了不同群体之间共有和特有ARGs 的数量。在7、14、21、28日龄时，4组之间共享的ARG数量分别为167、196、205、203 个。图4（B）是各组之间注释的ARO 数量。结果显示，即使在未使用任何抗生素的对照组肉鸡的肠道微生物群中，也存在ARGs。此外，在7 日龄时，中剂量组的ARO 数量显著高于其他3组（P＜0.05）。

图4 不同组ARGs的Venn图和ARO数目统计图

对中剂量组（150 mg/kg）不同日龄样本中具有显著差异的耐药基因进行分析，根据LefSe 结果绘制聚类热图。如图5 所示，与14 日龄、21 日龄和28 日龄相比，7 日龄时肉鸡盲肠中相对丰度显著增加的耐药基因数量较多，包括lnuA、bahA、ermQ等16种耐药基因。

2.2 Bacillus velezensis H-7对金霉素作用下肉鸡生长性能、肠道菌群及其耐药基因的影响

2.2.1Bacillus velezensisH-7对肉鸡生长性能的影响

Bacillus velezensisH-7 对肉鸡生长性能的影响结果如表3 和表4 所示。从表3 可知，在21 日龄和35 日龄时，与AC 组相比，LP、MP、HP 组的肉鸡体重均有所增加，其中21 日龄时MP 组肉鸡体重与AC 组相比增加6.2%（P＜0.05）。35 日龄时，与BC 组相比，益生菌组和抗生素对照组的体重均显著增加（P＜0.05）。但各组间的料重比无显著差异（P＞0.05）。

表3 不同时间点肉鸡体重统计（n=3）

表4 7～35日龄肉鸡料重比结果（n=3）

2.2.2Bacillus velezensisH-7 对肉鸡肠道菌群组成的影响

图6 是在门水平下各组间排名前10 的物种相对丰度柱状图。在门水平下，7 日龄时各组间的优势菌门为Firmicutes 和Proteobacteria，两者物种的相对丰度约占总菌门的86%。21日龄时，物种间的相对丰度发生变化，各组间的优势菌门主要为Firmicutes、Bac‐teroidetes、Proteobacteria、Verrucomicrobia 和Teneri‐cutes。与对照组AC 相比，21 日龄时LP、MP 和HP 组肉鸡盲肠菌群中Firmicutes 的相对丰度显著增高（P＜0.05），且MP 组增加最为显著，且与空白对照组BC 相比，无显著差异（P＞0.05）。而LP、MP、HP 组盲肠菌群中的Bacteroidetes 与AC 组相比显著减少（P＜0.05）。对21 日龄各组间Firmicutes/ Bacteroidetes（F/B）的比值进行分析，结果如表5 所示，LP、MP、HP 组F/B 与AC组相比显著提高（P＜0.05）。

图6 门水平下物种相对丰度柱形图

表5 21日龄各组Firmicutes与Bacteroidetes比值结果

图7 是属水平下各组间排名前10 物种的相对丰度柱形图。属水平下各组排名前10 的物种分别为Lachnoclostridium、Alistipes、Bacteroides、Clostridium、Helicobacter、Barnesiella、Blautia、Flavonifractor、Faeca⁃libacterium和Pseudoflavonifractor。7 日龄肉鸡盲肠菌群以Lachnoclostridium、Clostridium、Blautia和Flavoni⁃fractor为主。21日龄时，抗生素对照AC 组中Bacteroi⁃des的相对丰度显著高于BC、LP、MP、HP组，而Blautia和Clostridium的相对丰度与LP、MP、HP 组相比显著降低（P＜0.05）。

图7 属水平下各组物种相对丰度柱形图

2.2.3Bacillus velezensisH-7 对肉鸡肠道差异物种组成的影响

基于21 日龄和35 日龄组间差异物种LEfSe 分析结果，选择属水平下的组间差异物种绘制聚类热图以反映这些差异物种在各样品中分布情况，结果如图8所示。21 日龄时，与AC 组和BC 组相比，LP、MP、HP组的肉鸡盲肠主要富集Akkermansia、Ruminococcus、Blautia、Bacillus、Corallococcus和Lactobacillus，其 中MP 组中这些物种的相对丰度高于LP 组和HP 组。LP、MP、HP 组的Faecalibacterium、Bacteroides、Flavoni⁃fractor等物种丰度低于AC 组。35 日龄时，各组盲肠微生物中主要差异物种与21 日龄时存在较大的差异。与AC 组相比，MP 组肉鸡盲肠主要富集Blautia、Pseudoflavonifractor、Flavonifractor和Alistipes，而在LP和HP组中这些物种丰度与AC组相似。

图8 基于显著差异物种的丰度聚类热图（属水平）

2.2.4Bacillus velezensisH-7 对肉鸡肠道耐药基因的影响

利用CARD 数据库对ARGs 进行注释，获得耐药基因丰度表并进行分析。统计各个样品排名前20的耐药基因相对丰度，结果如图9所示。由图9可知，各组间主要的耐药基因是四环素类、大环内酯-林可酰胺-链霉菌素类（MLSB）、氨基糖苷类，其中几乎所有样品中均含有四环素类耐药基因（tetW/N/W、tetQ、tet44、tet40、tetO、tetL）。21日龄时，与AC组相比，LP、HP组中tetQ、adeF的相对丰度显著降低（P＜0.05），而AAC6-Ie-APH2-Ia和lnuC的相对丰度显著升高（P＜0.05）。随着时间的推移，HP组与AC组和BC组间耐药基因组成的差别逐渐缩小。通过丰度聚类热图（图10）可以发现，在7 日龄时，由于添加了金霉素，四环素耐药基因tetO、tet40 和tet32在抗生素对照AC组明显富集。与对照组相比，21日龄和35 日龄时益生菌组主要富集氨基糖苷类（如ANT6-Ia、APH3-IIIa和aad6）和MLSB类（ErmG、ErmB、ErmF和ErmS）耐药基因。

图9 不同ARO在各样品中的丰度柱形图

图10 耐药基因丰度聚类热图

3 讨论

3.1 不同剂量金霉素对肉鸡肠道菌群和耐药基因的影响

正常生理状态下，畜禽肠道微生物群保持平衡，对促进宿主发育、免疫和代谢起着重要作用，一旦肠道菌群失调，会引发各种肠道内、外疾病。而抗生素滥用已成为引起肠道菌群失调的重要原因。本研究表明，生命早期微生物群落结构不稳定，微生物定植和免疫受到生命早期环境因素的影响。Simon 等[20]和Schokker等[21]的研究证实了抗生素诱导的蛋鸡早期肠道微生物群失调可能导致机体免疫发生改变。因此在生命早期施用较高剂量的抗生素对肉鸡肠道菌群组成有很大的影响。试验一中NMDS和聚类树分析结果发现，7日龄时，各组盲肠菌群组成与14日龄、21日龄和28日龄的存在显著差异，中剂量金霉素组对肉鸡盲肠菌群的影响大于对照组和低、高剂量组。此外，一些特定菌群丰度的增多或减少会致使肠道微生物进入一个条件致病的状态，极其容易被外源致病菌感染和破坏。研究表明，Bifidobacterium和Lactobacillus数量的下降，而En⁃terococcus和Enterobacter数量不下降或者下降比例低于Bifidobacterium和Lactobacillus是菌群失调的标准[22]。Bifidobacterium、Lactobacillus是肠道菌群中具有代表性的有益菌，能促进宿主健康生长。Enterococcus、Enterobacter是肠道菌群中常见的条件致病菌属，若大量繁殖就会对宿主产生不良影响。本试验结果表明抗生素的使用影响了肠道菌群的稳态，较高剂量（150 mg/kg）的抗生素可能导致肠道菌群失调。此外，在耐药基因的研究中也发现，在7日龄时，中剂量金霉素的施用增加了肉鸡肠道中耐药基因的种类和丰度，促进了相关四环素类耐药基因的富集。

3.2 Bacillus velezensis H-7对金霉素作用下肉鸡肠道菌群和耐药基因的影响

Firmicutes可以编码降解多糖的酶类，促进多糖的分解和能量利用，且Firmicutes 存在大量脂肪酸产生菌，较高的F/B 能加强对营养物质的吸收并产生更多的脂肪酸，从而提高脂肪沉积，促进肉鸡生长[23-24]。本试验研究表明，Bacillus velezensisH-7 显著提高21 日龄的F/B 比率，且21 日龄时，MP 组的肉鸡体重显著高于AC 组，即在金霉素作用后，添加Bacillus velezensisH-7 14 d后盲肠菌群发酵能力提高从而促进了脂肪的沉积。目前，许多研究都支持一个观点，即肠道中大量Proteobacteria反映了生态失调或者肠道菌群结构不稳定[25]。本试验发现21日龄时，MP、HP组的Proteobacte‐ria 相对丰度与抗生素对照AC 组和空白对照BC 组相比显著减少（P＜0.05），表明Bacillus velezensisH-7能降低Proteobacteria 的丰度来维持肠道菌群的稳态。另外还发现，与对照组AC相比，21日龄时，LP、MP、HP 组的肉鸡盲肠中Akkermansia、Ruminococcus、Blautia、Bacil⁃lus、Lactobacillus的丰度显著增加，表明，添加Bacillus velezensisH-7 能促进肉鸡盲肠有益菌的富集。而Ba⁃cillus的丰度增加，表明Bacillus velezensisH-7 在肉鸡盲肠中能够很好的定植。其中Akkermansia是近年来最受关注的明星菌株之一，它主要定植在肠黏膜层。Akkermansia丰度的提高可以增加肠道黏膜厚度、增强肠道屏障，有益于代谢和免疫响应[26]。Ruminococcus可以降解纤维素，生成琥珀酸，促进物质的分解和吸收。在人类口服补充益生菌试验中也能发现Akkermansia和Ruminococcus的丰度升高[27]。但对于菌群变化与免疫和代谢之间的相关性有待进一步深入研究。此外，本试验研究发现，益生菌的饲喂，使得肉鸡肠道中四环素类耐药基因丰度降低，但增加了氨基糖苷类和MLSB类耐药基因，可能是肠道菌群发生变化促进了耐药基因丰度的转移，具体原因还需要进一步分析。

4 结论

① 在肉鸡生命早期（7 日龄）时，添加150 mg/kg的金霉素使肉鸡肠道菌群中有益菌属Bifidobacte⁃rium、Lactobacillus丰度显著降低，肠道常见条件致病菌Enterococcus、Enterobacter的丰度上升，且耐药基因丰度上升，对肉鸡肠道菌群影响最大。

② 饲喂金霉素7 d 后，添加Bacillus velezensisH-7（108～1010CFU/kg）能够显著增加21日龄肉鸡肠道中Firmicutes 的 相 对 丰 度，降 低Bacteroidetes 和Proteo‐bacteria 的相对丰度，显著提高F/B 的比值；可促进Ak⁃kermansia、Ruminococcus、Blautia、Bacillus和Lactoba⁃cillus等有益菌属的富集，同时降低了相关四环素类耐药基因的丰度。