宏基因组二代测序在耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌医院感染暴发中的应用

范鹏超,刘 贺,巴婧翀,刘文芝

(大连医科大学附属第二医院疾病预防与医院感染控制部,辽宁 大连 116023)

鲍曼不动杆菌是一种非发酵的革兰阴性杆菌,可定植于人体皮肤、呼吸道、泌尿道及自然环境中,常引起血液、泌尿道及下呼吸道等多部位感染,是医院感染的主要病原菌之一[1]。碳青霉烯类药物是治疗鲍曼不动杆菌感染的推荐药物,但随着碳青霉烯类药物使用量逐年增加,免疫抑制剂等广泛使用,以及感染防控措施落实不到位,耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumanii, CRAB)的检出率与感染率逐年增加[2]。重症监护病房(intensive care unit, ICU)收治的患者普遍免疫力低下,是发生医院感染的高危人群[3],同时多数患者需要接受气管插管、泌尿道或中心静脉置管等高风险性侵袭操作,一旦发生CRAB医院感染暴发事件将产生严重影响。近年来,宏基因组二代测序(metaganomic next-generation sequencing, mNGS)技术逐渐发展成为检测病原体的新手段,此方法快速精准,阳性率高,可准确客观且快速高效地检测多种病原微生物,已在多个领域广泛应用[4-5],但mNGS应用于疑似医院感染暴发事件调查的报道较少。2023年6月8—22日某院ICU 5例患者的标本检出CRAB,此5例患者入院时间存在交叉,床位分布存在空间关联,本研究利用mNGS技术分析此次疑似暴发事件,为CRAB感染的预防与控制提供科学依据,现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例资料 2023年6月8—22日该院ICU共收治16例患者,其中病例1、2、3、4查体时,肺部听诊有啰音,影像学表现为片状高密度阴影,病例5出现恶心、头痛,且磁共振显示脑内弥漫性水肿,3例患者的痰标本、1例患者的肺泡灌洗液标本及1例患者的脑脊液标本培养结果回报为CRAB。为进行精准抗感染治疗及采取医院感染防控措施,6月14—22日ICU陆续采集上述5例患者标本进行mNGS检测。本研究通过该院伦理委员会批准(No. 2023—1061),所有患者均知情并签署知情同意书。

1.2 病原学检测方法

1.2.1 病原菌培养 参照《全国临床检验操作规程(第四版)》[6]进行标本采集与送检,使用VITEK 2 Compact分析仪及配套鉴定卡、药敏卡片进行细菌种属鉴定及药物敏感试验。

1.2.2 mNGS检测 (1)标本采集:使用无菌干燥的洁净冻存管(PMseq检测采集管)采集3例患者的痰标本(患者均使用生理盐水等进行口腔护理,用力排咳留取深部痰3 mL),1例患者的肺泡灌洗液(弃去前端可能污染的部分,收集其余部分3 mL)及1例患者的脑脊液标本(为减少污染,采集第2管脑脊液);(2)送至中国华大基因进行mNGS检测,分析标本中微生物并与数据库原核酸序列进行比较、鉴定。

1.3 调查方法

1.3.1 现场流行病学调查 2023年6月22日该院感染控制专职人员使用众智医院感染监测预警系统v10.2,显示5例CRAB感染,医院感染控制部立即成立调查小组,利用HIS系统查阅病例并第一时间进行床旁调查,与主管医生、护士、药学部等进行讨论,进行风险评估后并立即采取医院感染控制措施。

1.3.2 结果判定 根据卫生部2001年颁布的《医院感染诊断标准(试行)》[7]对以上患者进行医院感染诊断。根据《医院感染暴发控制指南》[8],短时间内发生3例以上临床症候群相似,怀疑有共同感染源的感染病例的现象,综合患者症状、病原体分离情况、时间及空间分布等,考虑为医院感染暴发。

1.3.3 环境卫生学监测 医院感染控制部对可疑污染的ICU床单元、病区环境设备及医务人员手等115个点位进行环境微生物采样,用浸有中和剂(卵磷脂吐温胰蛋白胨大豆培养基复方中和剂,购自贝瑞特生物技术有限责任公司)的无菌拭子进行涂抹,并接种于耐碳青霉烯肠杆菌目检测用培养基(CRE显色培养基,购自沈阳彦程生物制品有限公司),立即置于37℃暖箱培养48 h后观察菌落情况,对可疑菌株进行鉴定及药敏试验。

1.3.4 医院感染控制措施 结合环境微生物学结果,通过RCA根因分析等方法,组织流行病学调查小组联合行政、医疗、护理管理人员展开分析讨论,制定以下感染控制措施:(1)立即进行彻底的环境卫生清洁消毒工作,将目前CRAB患者按区域收治,护理人员不得交叉;(2)规范合理使用隔离衣,隔离衣一人一用一换;(3)对全科人员开展手卫生培训及考核;(4)同期所有患者全部送检微生物标本;(5)护理操作时尽可能使用密闭式吸痰器,防止气溶胶喷溅操作。

1.4 统计学方法 应用SPSS 23.0对所有数据进行统计学分析,定性资料比较采用χ2检验,两组间定量资料比较采用t检验,P≤0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 流行病学特征

2.1.1 人群分布 2023年6月8—22日ICU共收治16例患者,其中男性10例,女性6例,年龄23～91岁,平均年龄(68±2.23)岁,其中3例患者痰标本、1例患者肺泡灌洗液标本及1例患者脑脊液标本检出CRAB,以上患者均接受气管插管辅助通气。5例检出CRAB患者的基本情况见表1。

表1 ICU 5例检出CRAB患者的基本情况

2.1.2 时间分布 病例1首次于6月14日检出CRAB,病例2～5于6月16—22日陆续检出,结合临床症状病例1～5于6月14—22日进行第二次微生物培养送检并进行mNGS检测,见表2。

表2 5例患者微生物培养送检时间及结果

2.1.3 空间分布 ICU开放床位28张,6月8—22日在院患者16例,病例3、病例4检出CRAB后床位分别调整至22、27床,便于分区域集中管理。见图1。

2.2 mNGS与传统病原学检测对比 5例患者标本培养结果均为CRAB。mNGS检测结果显示,5例患者标本均检出OXA-23耐药基因,见表3。mNGS结果回报所需时间短于培养所需时间[(3.92±1.05)d VS (6.24±0.25)d,t=-13.420,P<0.001)]。

表3 5例患者标本mNGS检测和传统培养结果比较

2.3 环境卫生学监测结果 共采集115份环境标本,59份检出CRAB,检出率为51.30%,以呼吸机按钮、移动护理车检出率最高(均为80.00%),其次为呼吸机外壳(75.00%)、呼吸机屏幕(70.00%),与患者药敏结果均一致,除替加环素敏感外其余检测抗菌药物均耐药,59份检出CRAB的标本中,呼吸机表面、移动护理车和医务人员手分别占50.85%(30份)、20.34%(12份)、13.56%(8份)。见表4。

表4 ICU环境卫生学监测结果

2.4 感染控制措施与效果评价 6月23日—7月1日感染控制措施实施情况统计结果显示,感染控制措施执行均有明显提高,见表5。5例患者预后较好,陆续于6月28日、6月30日、7月1日转出ICU。

表5 感染控制干预措施落实率(%)

3 讨论

该院为省级三级甲等医院,编制床位3 000张,ICU常收治病情较重的患者,患者携带多重耐药菌的概率较大。本研究中5例患者经过专家组会诊,给予如下结论:(1)病例1由外院转入,但无证据表明入院时携带且在入院48 h后检出CRAB,结合临床表现判定为医院感染;(2)病例3首次脑脊液培养阳性,第二次培养阴性,且患者血常规、颅内影像学等指标不支持感染,考虑为标本污染或定植,mNGS结果显示该患者标本检出OXA耐药基因,需严格防控CRAB定植转为感染的风险;(3)病例2、4、5考虑为患者机体免疫力下降、碳青霉烯类药物使用等原因造成的CRAB医院感染。根据专家会诊结论及《医院感染暴发控制指南》中医院感染暴发定义,考虑此次事件为CRAB医院感染暴发。

近年来,CRAB聚集或暴发事件较为常见,多地均有报道[9-10],但由于普通医疗机构缺乏同源性鉴定手段,当感染病例较少时无法判定为暴发事件。本研究中于6月14—22日陆续对5例患者标本进行mNGS检测,结果回报均早于传统微生物检测[(3.92±1.05)d VS (6.24±0.25)d,P<0.001],mNGS检测具有检出率高、耗时短、精准性强的优势。检出病原微生物是判定医院感染的重要依据,传统的微生物检测主要通过免疫、生化以及培养等试验方法检测标本中微生物种类与定量信息[11],但由于标本采集不规范、送检时机不合理及某些病原微生物常规下难以培养等原因,存在培养周期长、假阴性率高及效率较低等问题。基于mNGS技术对标本进行完全测序,具有灵敏度高、时间快等特点,在感染性疾病的早期诊断中,对于混合菌种的检出更具优势,从而可以采取干预措施,及时阻断传播途径,保护高危人群,降低医院感染风险。本研究中5株CRAB药敏结果显示,对亚胺培南和美罗培南两种药物的耐药率均为100%,mNGS检测均检出OXA-23耐药基因型,其序列数、相对丰度均较高,且未检出OXA-24、OXA-58等其他耐药基因,提示携带OXA-23基因是造成本次CRAB耐药的主要原因。研究[12]显示,只有同时携带OXA-51和OXA-23基因的鲍曼不动杆菌才对抗菌药物高度耐药,只携带OXA-51的鲍曼不动杆菌对抗菌药物则趋向敏感。因此,对于医院感染防控尤其ICU可借助mNGS技术,在目标菌感染暴发途径追踪及耐药基因研究时具有重要作用[13-14]。同时mNGS可以检测未知微生物包括病毒、真菌等,完善传统微生物检测上的不足,为临床诊疗及医院感染控制措施的制定提供可靠的决策依据[15],但mNGS检测结果受宿主背景微生物构成的影响,对标本要求高,极易被污染,且病原微生物的检出很大程度上依赖数据库的全面型与特异性,因此,存在假阳性、部分病原菌检出率低、成本高等问题,临床分析mNGS结果同时应结合患者临床症状及其他辅助诊断方法及检测结果,从而进行感染或定植的判定。

本次事件中,呼吸机表面、移动护理车及医务人员手均分离出CRAB,提示手卫生与环境清洁消毒的重要性。陈学斌等[16]研究指出,呼吸机外表面消毒不当是导致医院感染的重要原因。分析可能因为ICU收治的患者病情重、医务人员工作量较大,导致清洁消毒工作落实不足,还可能由于某些产生气溶胶喷溅的操作如吸痰、气道插管拔管等导致呼吸机外表面污染。中国研究型医院学会危重医学专委会护理研究学组研究提出,对多重耐药患者进行吸痰护理时,应尽可能使用密闭式吸痰器以防止气溶胶喷溅[17];ICU医护人员手卫生依从率较低也是本次传播链条的重要原因,感染控制措施干预前医生、护士手卫生依从率分别为40.83%(49/120)、67.96%(70/103),远低于其他地区的相关报道[18-19]。当进行与CRAB患者接触面积比较大的操作时,如翻身、拍背、康复治疗等,操作人员应穿隔离衣。隔离衣可以避免因接触导致病原体床单元等传播,本事件中隔离衣正确使用率仅为45.65%(21/46),可能与患者较多工作繁忙、医务人员对隔离穿衣的作用认识不足及隔离衣储备不足等有关,这些都有可能导致CRAB的进一步传播。通过多学科联合感染控制培训等PDCA质量控制,不仅手卫生依从率及相关措施落实率均有明显上升,对于患者预后起到重要作用,同时医院感染管理部也将此次指标定为每月质量控制基础数据,开展持续性监测提升感染控制意识。

综上所述,mNGS技术可以快速鉴别医院感染患者病原微生物特征,对于耐药基因可以开展分型研究,对多重耐药菌感染患者的抗感染治疗以及医院感染防控措施制定具有重要意义,针对性的加强消毒隔离工作与提高手卫生依从率是防控CRAB的重要手段。本研究也存在一定局限性,由于成本及技术原因无法对环境中的CRAB进行耐药基因检测,因此仅能对医院感染传播途径进行推测。本次事件发生后感染管理部门予以高度重视,采取积极干预措施,应用mNGS技术配合感染控制措施取得较好效果,故总结经验,以期为感染的预防与控制提供参考。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。