蜚蠊改善错配修复基因缺失肠癌细胞对氟尿嘧啶敏感性的机制研究

2024-02-23谭诗生

中国中西医结合外科杂志 2024年1期

彭雯，秦琴，王巧，谭诗生

大肠癌（colorectal cancers, CRC）的发病率及死亡率在我国呈逐年升高趋势，严重危害人类健康[1]。由于大肠癌早期的临床症状不典型，早筛的普及性较差，大部分患者就诊时已经是中晚期，丧失了手术机会，所以化疗仍然是大肠癌的主要治疗手段之一。目前针对大肠癌的标准化疗方案是以氟尿嘧啶为基础的联合方案[2]，但由于错配修复基因缺失（deficient mismatch repair, dMMR），导致肠癌患者天然对氟尿嘧啶药物不敏感[3-4]，以致患者不能从治疗中获益。以往研究显示中药土家蜚蠊对大肠癌具有抗肿瘤作用[5]。本研究将蜚蠊与氟尿嘧啶（5-FU）联合作用于dMMR 肠癌细胞，探究蜚蠊联合氟尿嘧啶对dMMR 大肠癌细胞的增效作用，并应用脂质组学技术挖掘相关通路及机制，以期为临床提高dMMR 大肠癌患者的疗效提供有效策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞人源大肠癌HCT116、DLD1 细胞株购自美国ATCC 细胞库，由四川大学生物治疗实验室冻存保管，前期研究证实HCT116 为MLH1 基因缺失细胞，DLD1 为MSH6 基因缺失细胞，均为dMMR大肠癌细胞[6]。

1.1.2 药物蜚蠊脱脂精粉（生产批号：202040328-02）购于弥渡县云峰美蠊养殖基地。蜚蠊含药血清制备：1）SPF 级SD 大鼠，随机分为2组，空白对照组（NC）和蜚蠊含药血清组（FL），蜚蠊组按成人临床等效剂量（15 g/60 kg）的10 倍来配制蜚蠊混悬液，药物浓度为0.25 g/mL，按10 mL/kg 灌胃给药，空白对照组以等剂量生理盐水灌胃，1 次/d，连续饲养7 d。2）大鼠末次灌胃1 h 后，采集腹主动脉血，留取血清，分装保存至-20 ℃冰箱。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT 法检测蜚蠊对HCT116、DLD1 肠癌细胞增殖的抑制作用将100 μL 配制好的蜚蠊加入96孔板中，每孔按总体积的1.5%、3%、6%、12%、24%比例加入5-FU，配置成0.6、1.25、2.5、5、10 μmol/L不同剂量，加入96 孔板中，FL+5-FU 根据上述剂量联合作用于细胞，每组剂量重复3 次，作用24 h、48 h 和72 h 后进行MTT 测定，抑制率=[1－(实验孔OD值－空白组OD 值]/(对照孔OD 值－空白组OD 值)×100%。

1.2.2 通过Calcusyn2.0 计算两药联合治疗指数（CI值）药物联合治疗目的是达到协同增效。联合治疗指数CI 是量化协同作用简单的方法。本研究依据Calcusyn 软件的Chou and Talalay[7]方法，分析用不同浓度蜚蠊和5-FU 药物组合联合共同处理48 h结直肠癌细胞的细胞毒性。CI＜0.75 为协同作用，0.75～1.25 为叠加作用，CI＞1.25 为拮抗作用。

1.2.3 基因本体论(gene ontology, GO)功能富集分析 GO 分析的主要作用是对差异表达的基因进行基因功能注释分析，通过OmicShare 云平台进入GO 数据库，上传二代测序获得蜚蠊联合5-FU 与5-FU 单药间差异基因，用DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）对差异基因的功能进行注释分析，寻找两组之间的差异通路。

1.2.4 高效液相色谱质谱串联仪（LC/MS）进行脂质检测药物作用72 h 后对细胞进行脂相提取，Acquity UPLC 系统进样分析[8]，利用Q-TOF 质谱(waters, manchester, U.K.) 进行全脂质组学的测定。在数据库 Lipid Maps Database 和 Human Metabolome Database 中，利用m/z 鉴定代谢物，最后将数据导入Progenesis QI（newcastle, UK1）进行校准。对代谢物进行非成对模式t 检验，筛选出有统计学差异的代谢物（P＜0.05）。

1.3 统计学分析所有数据采用SPSS 19.0 和Graphpad prism 7.0 软件进行分析及作图，组间率的比较采取ANOVA 方法进行检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蜚蠊含药血清对大肠癌细胞增殖的抑制作用MTT 实验结果显示，不同蜚蠊浓度对HCT116 和DLD1 细胞均显示出抑制作用，但抑制率不随浓度加大而升高，统计学无意义。蜚蠊浓度为6%时对HCT116 和DLD1 细胞抑制作用较为明显。蜚蠊与5-FU 联合作用HCT116 和DLD1 细胞后显示出较好的抑制作用，且随5-FU 浓度增加抑制率越好，差异均有统计学意义（P＜0.05，表1～4）。

表1 FL 在不同浓度及时间对HCT116 细胞的抑制率

表2 FL+5-FU 在不同浓度及时间对HCT116 细胞的抑制率

表3 FL 在不同浓度及时间对DLD1 细胞的抑制率

表4 FL+5-FU 在不同浓度及时间对DLD1 细胞的抑制率

2.2 蜚蠊联合5-FU 对结直肠癌细胞的联合治疗指数（CI）值检测给予上述同剂量的蜚蠊与不同剂量5-FU 联合作用HCT116 和DLD1 细胞后，在HCT116 细胞中，蜚蠊浓度在6%时与5-FU 10 μmol/L 组合的CI 指数为0.24。在DLD1 细胞中，相同剂量组合两药CI 指数为0.35，CI 指数明显低于0.75，表明当蜚蠊浓度在6%时与5-FU 10 μmol/L结合时，协同抗增殖作用最强，见图1。所以本研究选择HCT116 细胞进行后续实验研究。

图1 蜚蠊与5-FU 联合用药后在HCT116、DLD1 大肠癌细胞中CI 值

2.3 基因测序检测两药联合后差异基因及KEGG富集分析基因测序发现两药联合与5-FU 单药之间有3276 个基因发生显著变化（FC＞1.5，FDR＜0.05），通过京都基因和基因组数据库（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析显示，最重要的富集通路在脂质代谢、自噬、黏附物连接和PI3K-AKT-mTOR 等通路（图2）。

图2 蜚蠊与5-FU 联合用药后在HCT116 细胞中差异基因及通路变化

2.4 GO 功能分析 GO 功能分析发现主要生物过程包括脂肪酸代谢、血管内皮改变、自噬调控、凋亡发生及细胞黏附等生物学过程发生主要改变（图3）。对通路中显著差异变化基因进行挖掘，脂肪酸代谢发现脂滴（LD）、去饱和酶1（SCD1）、Acyl-CoA 合成酶1（ACSL1）、Acyl-CoA 合成酶（ACSL4）、ELOVL6、ACAT1 基因发生显著改变。凋亡通路中CDKN1A、CDKN2A 和FASLG 基因变化显著（图3）。

图3 GO 功能分析HCT116 细胞中蜚蠊联合5-FU用药组与5-FU 单药组主要生物学改变中基因情况

2.5 脂质组学检测蜚蠊联合5-FU 处理HCT116细胞后，对脂质组学检测出的差异代谢物进行鉴定，鉴定出153 个脂质分子，包括脂肪类（62 个分子）、鞘脂代谢物（11 个分子）、磷脂代谢物（47 个分子）和甘油酯（33 个分子），见表5。

表5 脂质种类和数量表达情况

3 讨论

虽然已有越来越多的治疗方法应用于大肠癌患者，但由于大肠癌属于“冷肿瘤”，免疫治疗效果欠佳，靶向药物需要与化疗药物联合应用才能发挥较大的抗肿瘤作用，所以化疗仍然是大肠癌患者的主要治疗手段之一。5-FU 为结直肠癌患者化疗的基本用药，应用于术后辅助治疗及晚期患者多线治疗。但dMMR 肠癌患者对5-FU“天然耐药”或抵抗不能获益，影响了患者预后，因此，如何提高5-FU 在dMMR 肠癌患者的疗效是亟待解决的重要问题。有研究发现，美洲大蠊提取物对食管癌、胃癌细胞均有抑制作用[9]，并且可以逆转人肝癌细胞的多药耐药性[10-12]。本研究应用中西医结合治疗理念，应用土家药蜚蠊与5-FU 联合用于dMMR 大肠癌细胞，探讨中药蜚蠊改善5-FU 在dMMR 肠癌细胞中疗效的相关性，发现脂质代谢、自噬和凋亡等生物信号发生主要改变，两药联合可能通过脂质代谢途径逆转耐药，从而达到协同增效作用。

本研究发现，脂质代谢在两药协同增效上发挥重要作用，应用LC/MS 技术进行脂质组学检测到磷脂和甘油酯代谢异常。膜磷脂（包括PC、PE、PI、PA和Cer）是调节细胞增殖和耐药的重要信号分子，磷脂的代谢改变有助于肿瘤的进展和耐药[13]。其中ACSL 是调节脂质代谢的关键酶，包括脂肪酸伸长、氧化分解、磷脂生成和蛋白质酰化，与转移和不良生存预后相关[14]，脂滴（LD）由脂质核心（甘油酯和甾醇酯）组成, 研究证实抑制LD 的积累可以改善5-FU 的疗效[15-16]。SCD1 是生成复合脂质如磷脂、甘油三酯和胆固醇酯的关键基质。敲除SCD1 可以抑制肿瘤细胞的侵袭性，使肿瘤患者对各种治疗更敏感[17-18]。同时，本研究发现凋亡通路发生显著改变，FASLG 基因是肿瘤坏死因子家族成员，CDKN1A、CDKN2A 在凋亡执行过程中发挥重要作用。磷脂代谢异常引起脂肪酸及神经酰胺代谢异常诱导凋亡的发生（图4）。因此，蜚蠊改善5-FU 疗效可能是通过脂质代谢改变诱导细胞凋亡达到协同增效作用。