无花果叶提取液复合保鲜膜的研制及其在甜瓜保鲜上的应用

姚 军,秦 勇,郑贺云,张翠环,再吐娜·买买提,汪志伟,耿新丽

(1.新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所,新疆鄯善 838200;2.新疆农业大学园艺学院,乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】无花果(FicuscaricaLinn.)属桑科榕属的落叶植物,我国无花果的主产区包括新疆、江苏和浙江等地,无花果具有丰富的营养价值和较高的药用价值,无花果叶片中含有黄酮[1-2]、多糖[3-4]、多酚[5-6]及香豆素等化合物成分[7-9]。这些成分具有较好的抗氧化[10]、抗炎[11]、抗菌[12,13],还对预防骨质疏松[14]、降低血糖含量[15]等具有较好的作用。目前,研发新型保鲜剂的热点主要集中在植物源材料上[16],无花果叶提取物无毒、廉价、绿色环保,将其应用于甜瓜的保鲜中具有广阔的应用前景。【前人研究进展】在农作物病害防治上丁香、银杏、毛穗藜芦等植物提取物具有较好的抑菌效果[17-21],无花果叶提取液对革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)[22]具有较显著的抑菌作用。王桂亭等[23]研究表明,无花果叶乙醇提取物对金黄色葡萄球菌等 8 种常见菌株具有较显著的抑菌效果。胡丽丽等[24]研究无花果叶主要活性物质-补骨脂素的提取物对苹果腐烂病菌、棉花枯萎病菌、小麦赤霉病菌表现出了较好的抑制效果。【本研究切入点】目前研究仅停留在抑菌阶段,应用于生产实践的报道很少。链格孢与镰刀菌是甜瓜贮藏期的主要致病菌,也是造成甜瓜腐烂损失的重要原因之一[25]。无花果叶提取液显著的抑菌性能引起重视,目前更多的研究主要集中医学方面,在果蔬保鲜方面的研究鲜见报道。需研究分析无花果叶提取液复合保鲜膜的研制及其在甜瓜保鲜上的应用效果。【拟解决的关键问题】采用响应面法对无花果叶的提取工艺进行优化,获取含量和纯度较高的黄酮类化合物为主的提取物,将提取物作用于甜瓜贮藏期主要的致病菌进行抑菌性验证,分析无花果叶提取物在甜瓜贮藏保鲜上的抑菌性能,研究无花果叶提取液与成膜剂、抗氧化剂、其他助剂配成复合膜,优选指标为腐烂率和失重率,利用正交试验筛选出对甜瓜采后具有最佳保鲜效果的复合保鲜膜配方,为甜瓜采后植物源贮藏保鲜技术提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

无花果叶片(采自新疆鄯善县周边)、芦丁指示剂、95%的乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、均为分析纯;海藻酸钠、蔗糖酯、柠檬酸均为食品级;FAD培养基。

镰刀菌和链格孢,均从贮藏期的甜瓜腐烂部位分离纯化得到,保存在新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所甜瓜贮藏与运输课题实验室。

超声波细胞粉碎仪(宁波新芝,型号Scientz-IID),旋转蒸发仪(上海亚荣,型号RE2000),超净工作台。

以甜瓜西州密25号为材料,选取相近糖度(可溶性固形物在14%～16%)、果形大小均匀的无病虫斑、无机械损伤的果实。

1.2 方 法

1.2.1 原料预处理

除去无花果叶上的残根杂质、洗净、自然阴干,放置于60℃干燥箱中烘干后粉碎,过80目筛成干粉备用。

1.2.2 无花果叶黄酮类的提取和测定

(1)无花果叶黄酮的提取。称取无花果叶干粉5.0 g放入150 mL锥形瓶中,加入70%乙醇溶液100 mL,在室温下浸泡12 h,放入超声波细胞粉碎仪内超声30 min。用滤纸过滤处理后的无花果叶乙醇提取液,用旋转蒸发仪(温度60℃)减压蒸馏10 min,获得无花果叶浓缩液,密封保存。

(2)无花果叶总黄酮标准曲线的绘制。取芦丁标准品10 mg,用60%乙醇溶液溶解,定容于50 mL的容量瓶内,配成0.5 mg/mL的标准溶液。分别取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的标准溶液加入到10 mL带刻度的试管内,首先加入0.4 mL 5% 的NaNO2溶液静置6 min;加入0.4 mL 10% 的Al(NO3)3溶液后静置6 min;再加入4.0 mL 4.2% NaOH溶液后加蒸馏水定容至10 mL,静置10 min。在波长510 nm下测定吸光值,根据吸光值绘制标准曲线。

标准曲线方程为:

C=0.107 3A-0.099 4R2=0.999 4.

式中,C为标准品芦丁浓度C(mg/mL);A为吸光值。

(3)无花果叶黄酮取得率的计算。量取无花果叶浸提液4 mL,放入10 mL的刻度试管内,首先加入0.4 mL 5%的NaNO2溶液静置6 min;然后加入0.4 mL 10%的Al(NO3)3溶液后静置6 min;再加入4.0 mL 4.2%NaOH溶液后加蒸馏水定容至10 mL,静置10 min。在波长510 nm下测定吸光值,代入标准曲线获得样品液的质量浓度C(mg/mL)。由样品液的体积V(mL)、样品的质量m(g)计算无花果叶总黄酮取得率(%)。

Y=(无花果叶黄酮质量/无花果叶质量)×100%=(C×V/m)×100%.

1.2.3 响应面法优化无花果叶中总黄酮的提取工艺

分别以乙醇浓度、料液比、超声时间为影响因素,设置三个因素的不同水平,分析不同提取条件下无花果叶中总黄酮取得率的影响,采用Box-behnken设计方法进行试验设计。

1.2.4 无花果叶提取液抑菌性测定

将无花果叶按照提取工艺的优化方案制备母液,将母液制成含系列浓度药剂的PDA培养基中,有效成分浓度设计为100.000 0、50.000 0、25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5、0.781 25 μg/mL,采用无菌水作空白对照,各处理重复3次。选取杀菌剂阿米西达500倍液(主要成分25% 醚菌酯)与无花果叶提取液(相同浓度)进行对比试验。将分离纯化的镰刀菌、链格孢菌株,在PDA培养基28℃下活化72 h, 然后用打孔器在近菌落边缘取菌制成直径为6 mm的菌饼,并转接到含无花果叶提取液的PDA平皿和空白对照中。28℃ 培养72、96 h,采用十字交叉法量取菌落直径。

菌丝生长平均抑制率 =[(对照菌落直径均值-处理菌落直径均值)/(对照菌落直径均值-接种菌饼直径)]×100%。

1.2.5 无花果提取液复合膜保鲜剂的配制

称取一定量的成膜剂海藻酸钠,加入适量蒸馏水溶胀8 h,搅拌溶解;然后加入柠檬酸,搅拌溶解;再加入溶解后的蔗糖酯,最后加入无花果提取液,各组分按1∶1∶1∶1比例混合,搅拌均匀,配制成各种浓度的无花果提取液复合膜保鲜剂,备用。

1.2.6 甜瓜采后处理最佳复合保鲜膜配方筛选

选取海藻酸钠作为被膜剂,柠檬酸作为抗氧化剂,并添加蔗糖酯作为助剂,无花果叶提取剂作为杀菌剂,组成无花果叶提取剂复合膜。每种成分设置3个浓度,采用L9(34)即3水平4因素的正交试验。表1

表1 L9(34)3水平4因素的正交试验

按正交试验设计顺序手工均匀涂膜各种果实,于干燥阴凉处自然晾干。每个处理10个果实,共计81个处理,将各处理哈密瓜置于6～8℃冷库内贮藏,每5 d统计各处理的腐烂率和失重率。以腐烂率和失重率为正交试验主要指标,进行极差及方差分析,确定应用于甜瓜生产中无花果叶提取液复合膜保鲜剂的最佳组成配方。

1.3 数据处理

每个指标测定值利用Excel进行统计分析并绘图,响应面分析采用designer expert软件完成,数据的方差分析(ANOVA)利用SPSS.17.0数据处理软件完成,并采用Duncan’s多重比较法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 响应面法各因素各水平的判定

2.1.1 响应面法优化无花果叶总黄酮的提取工艺

研究表明,以乙醇浓度%(A)、超声时间min(B)、料液比%(C)为自变量,总黄酮得率Y为响应值,采用designer expert软件对响应面分析。响应值Y与自变量A、B、C拟合得到的响应面二次方程为:

Y(mg/g)=-42.550 84+0.766 06A+0.771 22B+56.270 23C-2.100 001 0-4AB+0.329 63AC-1.566 67BC-5.145 001 0-3A2-9.705 001 0-3B2-118.655 69C2。

2.1.2 响应面

研究表明,失拟项不显著(P=0.105 9>0.05),模型中一次项C为极显著,二次项A2、B2为极显著,B、C为显著;整体模型的显著水平P<0.01,该模型为极显著。Pred(R2)为0.952 8而Adj(R2)为0.892 1,拟合的模型方程较好。表2,表3

表2 响应面结果

表3 回归模型方差

2.1.3 各因素相互作用对无花果叶总黄酮取得率的影响

研究表明,无花果叶总黄酮取得率的影响最为显著的因素为料液比和乙醇浓度,表现为曲线较陡,超声时间影响较小,曲线较平滑,无花果叶黄酮取得率的变化较小。图1

图1 各因素对提取率的响应面

2.1.4 条件的优化与验证

研究表明,最优提取工艺条件为:乙醇浓度79.73%、超声时间为36.81 min、料液比为1∶24,理论含量为1.58%,试验所得结果为1.53%,实际含量和理论含量相对误差为2.96%,二者较为接近,因此响应面设计所得结果准确可靠。

2.2 无花果叶提取液的抑菌效果

研究表明,随着各处理浓度的增大,两种菌株的菌株直径逐渐减小,无花果叶具有抑制甜瓜贮藏期真菌病害的作用。各处理浓度之间差异达到显著甚至极显著水平,其中无花果叶提取液各处理浓度之间对镰刀菌的抑制均达到了极显著水平。对比无花果叶提取液和药剂阿米西达的抑制效果,无花果叶提取液的抑制效果较化学杀菌剂略差,100 μg/mL 处理浓度抑菌率低于化学杀菌剂的18.17%和17.84%。表4

表4 无花果叶提取液和阿米西达下甜瓜真菌病害镰刀菌和链格孢抑菌性变化

2.3 无花果叶提取液复合保鲜膜的研制

研究表明,各因素水平对哈密瓜失重率影响的强弱顺序为A3>A1>A2,B3>B1>B2,C2>C3>C1,D2>D1>D3。表5

表5 单因素统计(失重率)

各因素在不同水平下腐烂率的平均值,通过分析,可以判定各因素水平对哈密瓜腐烂率影响的强弱顺序为A3>A2>A1,B2>B3>B1,C2>C1>C3,D1>D2>D3。表6

表6 单因素统计(腐烂率)

最优组合是A3B2C2D1,失重率来看,最优组合是A3B3C2D2。A因素对腐烂率和失重率的影响均排名第一,A因素应取A3;B因素对腐烂率和失重率的影响分别排名第二位和第三位,分析结果看,B因素应取B2、B3,取B2时,失重率比取B3减少6.35%,取B3时,腐烂率比B2减少19.47%,所以B因素应取B2; C因素对腐烂率和失重率的影响分别排名第四位和第三位,C因素应取C2,D因素对腐烂率和失重率的影响分别排名第四位和第三位,D因素应取D1、D2,取D1时,腐烂率比取D2减低12.89%,取D2时,失重率比取D1减少2.31%,所以D因素应取D2。所以得到的最优组合为A3B2C2D2,即80 mg/mL无花果提取液+1.5%海藻酸钠+500 mg/L柠檬酸+0.5%蔗糖酯的混合液。表7

表7 甜瓜植物复合保鲜膜正交试验与极差

3 讨 论

3.1模型的拟合程度良好,残差均由随机误差引起,未知因素对试验结果干扰较小[26]。响应曲面图中,曲线走势越陡,影响越显著,曲线走势越平滑,影响越小[27]。植物源杀菌剂低毒、低残留、易降解、不易引起抗药性等特点是有机合成农药无法比拟的[28-29]。通过design expert 软件得出的最优提取工艺条件为:乙醇浓度79.73%、超声时间为36.81 min、料液比为1∶24,理论得率为1.58%,试验所得结果为1.53%,实际得率和理论得率相对误差为2.96%,二者较为接近,因此响应面设计所得结果准确可靠,此模型可以用于无花果叶总黄酮提取工艺的优化。

3.2通过十字交叉法测定无花果叶提取液对甜瓜贮藏期主要的病原菌镰刀菌和链格孢菌的抑菌试验,与市售的杀菌剂阿米西达抑菌性进行比较。发现无花果叶具有抑制甜瓜贮藏期真菌病害的作用,且不同浓度之间差异达到显著和极显著水平。但抑制效果较化学杀菌剂略差,100 μg/mL 处理浓度时抑菌率低于化学杀菌剂的18.17%和17.84%。植物源杀菌剂低毒、低残留、易降解、不易引起抗药性。

4 结 论

无花果叶提取液的最佳提取工艺参数为乙醇体积百分比为79.73%、超声时间为36.81 min、料液比为1∶24。并采用十字交叉法测定提取液对甜瓜采后主要病原菌镰刀菌、链格孢的抑菌效果,无花果叶提取液各处理浓度对镰刀菌的抑制效果达到了极显著水平。无花果叶提取液复合膜保鲜的最佳组合是A3B2C2D2,即80 mg/mL无花果提取液+1.5%海藻酸钠+500 mg/L柠檬酸+0.5%蔗糖酯按1∶1∶1∶1比例混合。无花果叶提取液的复合保鲜膜在减少甜瓜贮藏期腐烂率和失重率降低上效果明显。