HPLC 法同时测定余甘子果核中6种鞣质类成分的含量

张利军 龙小妹 李 蓉 夏宗霄 郭 爽 古建兴 刘海鹏 范 源

1.云南中医药大学，云南 昆明 650500；2.云南中医药大学第二附属医院，云南 昆明 65004；3.云南中医药大学第一附属医院，云南 昆明 650021

余甘子(PhyllanthusemblicaL.)为大戟科叶下珠属植物，别名喉甘子、庵罗果、牛甘果等，广泛分布于我国西南等地区，其果实入口微涩，回味甘甜，故名余甘[1-3]。其果实肉质丰满，呈扁圆形，有深棱纹，果皮黄绿色，酸甜微涩，回味良久，具有较高的营养价值，可鲜食、加工以及药用[4]。余甘子味甘、酸、涩、凉，归肺、胃经[5]，其主要的化学成分包括酚酸类、黄酮类、萜类等[6]，其中酚酸类物质可以有效抑制急慢性炎症[7-8]。研究[9]表明，余甘子果实中含有没食子酸、鞣花酸、柯里拉京、诃黎勒酸等丰富的多酚化合物。现代药理研究[10-13]证实，余甘子多酚有抗氧化、抗菌、抗疲劳、护肝益肾、免疫调节、降血糖、抗癌、抗病毒等作用。

余甘子的研究主要集中在对余甘子果实及叶中总黄酮、多酚等物质的提取[14-15]，如郑玉忠等[16]采用HPLC法测定余甘子果实中没食子酸和鞣花酸的含量分析，于涛等[17]采用HPLC法测定余甘子果实中总酚类含量，关于余甘子果核有效成分的含量测定却鲜有报道。余甘子果核占干果质量的40%左右，在临床应用中并未严格区分余甘子果肉和果核，2020年版《中国药典》也仅收载了余甘子成熟干燥果实，并未对其果肉和果核有所规定[17]。为了更好地开发和完善余甘子植物的综合利用，使废弃的余甘子果核得到充分利用，减少资源浪费，因此，本试验以没食子酸、柯里拉京、GCG、诃黎勒酸、PGG、鞣花酸6种鞣质类成分为指标，旨在建立 HPLC 同时测定余甘子果核中6个成分含量的方法，为更好地评价余甘子质量提供简单可靠、快速、准确的检测方法，同时为进一步完善其质量标准提供一定的理论基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪 (美国Agilent 公司)，色谱柱为 Agilent Zorbax C18键合硅胶柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；超声波清洗机(深圳市即洁超声科技有限公司)；DFY-600 摇摆式高速万能粉碎机(永康式速锋工贸有限公司)；T-1000 型电子天平(上海浦春计量仪器有限公司)；AB265-SMET-TLER TOLEDO十万分之一分析天平(Mettler-tolido国际贸易(上海)有限公司)。

1.2 材料 没食子酸(批号：wkq16081904；纯度：98%；四川省维克奇生物科技有限公司)、柯里拉京(批号：MUST-21110216；纯度：99.55%；成都曼斯特生物科技有限公司)、GCG(批号：wkq20051403；纯度：98%；四川省维克奇生物科技有限公司)、诃黎勒酸(批号：wkq22042804；纯度：98%；四川省维克奇生物科技有限公司)、PGG(批号：PRF21060701；纯度：98%；成都普瑞法科技开发有限公司)、鞣花酸(批号：PRF10061143；纯度：98%；成都普瑞法科技开发有限公司)；甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Zorbax C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～6 min，5%～7% A；6～15 min，7%～25% A；15～30 min，25%～27% A；50～65 min，45%～65% A；65～66 min，65%～5% A)；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。理论塔板数按儿茶素计算应不低于3000。色谱图如图1所示。

A.混合对照品；B.供试品；C.空白试剂；1.没食子酸；2.柯里拉京；3.GCG；4.诃黎勒酸；5.PGG；6.鞣花酸

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 取没食子酸、柯里拉京、GCG、诃黎勒酸、PGG和鞣花酸对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成一定质量浓度的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密称取鲜品的余甘子果核粉末2.0 g，精密加 50 mL 的甲醇，超声(40 kHz，240 W)60 min，冷却后用甲醇补足减失质量，滤过，滤液挥干后用甲醇定容至 10 mL。

2.2.3 空白溶剂 因最终定容时所用的溶剂为甲醇，故本研究中以甲醇作为空白溶剂。

2.3 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下没食子酸(0.0418 mg/mL)、柯里拉京(0.0739 mg/mL)、GCG(0.0130 mg/mL)、诃黎勒酸(0.0709 mg/mL)、PGG(0.0458 mg/mL)和鞣花酸(0.0994 mg/mL)对照品溶液 2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL，按 2.1 项下色谱条件分别进样测定，记录峰面积。以没食子酸、柯里拉京、GCG、诃黎勒酸、PGG、鞣花酸的进样量(X，μg)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得到的线性回归结果考察见表1。

表1 线性回归结果考察表

2.4 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，在“2.1”项条件下连续进样 6 次，结果显示没食子酸、柯里拉京、GCG、诃黎勒酸、PGG、鞣花酸峰面积 RSD 分别为0.13%、1.83%、2.02%、0.27%、2.70%和0.83%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，在“2.1”项条件下，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 进样，结果显示没食子酸、柯里拉京、GCG、诃黎勒酸、PGG、鞣花酸10 h 内峰面积的 RSD 分别为1.81%、3.68%、2.37%、2.01%、2.13%和0.55%(n=7)，表明供试品溶液在 12 h 内稳定性良好。

2.6 重复性试验 取同一批余甘子果核粉末 6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样，结果显示没食子酸、柯里拉京、GCG、诃黎勒酸、PGG、鞣花酸的平均含量分别为0.1503 mg/g、0.1862 mg/g、0.0186 mg/g、0.0918 mg/g、0.1345 mg/g、0.3641 mg/g，RSD分别为1.19%、1.77%、2.70%、0.32%、0.47%和0.40%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验 精密称取已知含量的余甘子果核粉末6份，分别加入一定量的对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，在 “2.1” 项条件下进样测定，重复6次，计算6个成分的平均回收率。结果没食子酸、柯里拉京、GCG、诃黎勒酸、PGG、鞣花酸的平均加样回收率分别为101.40%、100.70%、102.07%、102.30%、102.97%和97.05%，RSD分别为1.90%、1.30%、1.33%、1.10%、1.21%和1.85% (n=6)，结果见表2。

表2 加样回收测定结果表

2.8 样品含量测定 取3个不同批次余甘子果核样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下条件下进样，测定6个成分的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果表 (mg/g，n=3)

3 讨论

云南省是余甘子野生资源分布区之一[18]，余甘子作为一种多民族习用药材，具有广泛的药学应用价值。本文参考了余甘子果实的分离方法，实验结果表明，选择甲醇-0.1%磷酸溶液作为流动相时，使用文中所选择的梯度洗脱程序，能保证样品的分离度。同时，在270 nm波长下各峰分离度良好，特征性强，峰数目较多。实验数据表明，余甘子果核中鞣花酸的含量最高，GCG的含量最低。鞣质酚酸类化合物是余甘子果核的主要有效成分，也有研究表明余甘子的有效成分主要集中在果肉，果核部分含量较少[19]，也仅对酚类成分进行笼统介绍，本文是对多个成分含量的具体测定，旨在对余甘子果核质量研究提供借鉴和参考。同时余甘子果核中含有丰富的脂质，蛋白质，矿物质，脂溶性纤维素，酚类物质，对人体保健具有重要作用，本文意在为余甘子果核药用价值的研究提供参考。

综上，目前关于余甘子果核相关成分含量测定的研究较少，本研究建立的方法操作简便、结果准确可靠，重复性好，专属性高，可用于余甘子中没食子酸、柯里拉京、GCG、诃黎勒酸、PGG、鞣花酸含量的同时测定。为余甘子药材的质量控制和开发利用奠定一定的基础。