甜菜多黏菌研究进展

张秀琪,张宗英,韩成贵,王 颖

(中国农业大学植物保护学院/农业农村部病虫害监测与绿色管理重点实验室,北京 100193)

0 引言

甜菜多黏菌(Polymyxabetae)是一种专性寄生的原生生物(protista),1958年意大利的KESKIN在甜菜根中首次发现P.betae,目前P.betae广泛分布于美国、德国、法国、英国、叙利亚、伊朗、加拿大、日本和中国,是甜菜坏死黄脉病毒(beet necrotic yellow vein virus,BNYVV)、甜菜土传病毒(beet soil-borne virus,BSBV)、甜菜土传花叶病毒(beet soil-borne mosaic virus,BSBMV)和甜菜Q病毒(beet virus Q,BVQ)的传播介体[1]。其中P.betae传播的BNYVV导致甜菜丛根病的发生,该病害是目前世界各甜菜产区最重要的病毒病害。P.betae只能寄生在寄主植物的根部,目前仍无法在人工培养基上培养,因而研究长期受限。近年来,随着培养体系的改进、检测技术及组学的快速发展,P.betae在生物学、基因组学以及病毒与介体互作方面出现新的进展。本文就P.betae的分类地位、生活史、寄主范围、培养体系、基因组分析、诊断与检测技术、P.betae与病毒及寄主的互作以及综合防治等方面进行简要综述。

1 甜菜多黏菌的分类地位

P.betae早期被认为是低等真菌,目前归属于原生生物,详细分类为植物寄生黏菌纲(Phytomyxea)、原质目(Plasmodiophorida)、根肿菌科(Plasmodiophoridae)、多黏菌属(Polymyxa)。根肿菌科内所有物种都是细胞内专性寄生物,具备如下共有特征:十字形核分裂、游动孢子一端着生两根不等长的鞭毛、具有多核的原质团阶段以及休眠孢子阶段。多黏菌属还包括禾谷多黏菌(Polymyxagraminis),两者在形态上类似,可由寄主范围及18S核糖体DNA分析加以区分。

2 甜菜多黏菌的生活史

P.betae的生活史分为休眠孢子形成期(sporogenic phase)和游动孢子囊形成期(sporangial phase)两个主要阶段。生命周期的每个阶段都开始于游动孢子穿透寄主细胞[2]。游动孢子通过鞭毛运动到寄主表面,这时鞭毛会失去活力,慢慢收缩,最后消失,游动孢子在根毛表面静止,伸出一个管状腔穿透寄主,进入寄主细胞内[3]。内容物在寄主体内扩展,将此时的形态称为产孢囊原质体,通过核分裂或相互融合形成一个大型的多核带隔菌体,即孢子囊,成熟后形成游动孢子囊[2,4]。孢子囊形成溢管,溶解寄主细胞壁,释放次级游动孢子,开启新一轮的侵染[2-4]。通过减数分裂在寄主细胞内形成单核的休眠孢子,未成熟的休眠孢子排列紧密,棱角分明,相邻的休眠孢子外壁互相溶合,形成鱼卵状的休眠孢子堆[4]。休眠孢子堆随着病残体越冬,来年再释放游动孢子进行初侵染。在侵染过程中,P.betae仅在根皮层组织内扩展,未能在寄主根部内皮层和中柱组织中观察到[5]。

3 甜菜多黏菌的寄主范围

P.betae的寄主范围较为有限,目前报道可侵染苋科、石竹科、罂粟科、禾本科、十字花科、旋花科和菊科等7科40余种植物(表1),但具有寄主专化型现象。1979年BARR等[6]在加拿大分离获得两个专化型P.betaef.sp.Amaranthi和P.betaef.sp.Betae,前者只侵染反枝苋(Amaranthusretroflexus),后者主要侵染甜菜(Betavulgaris)、藜(Chenopodiumalbum)、头状藜(Chenopodiumcapitatum)、Amaranthushortensis等植物。ABE等[7]在日本北海道病圃中测试23科108种植物,证实P.betae可侵染藜、墙生藜(Chenopodium murale)、小藜(Chenopodiumficifolium)、马齿苋(Portulacaoleracea)、大花马齿苋(P.grandiflora)、甜菜(BetavulgarisL.var.saccharifera)、瑞士甜菜(B.vulgarisL.var.cicla)、平匐甜菜(B.procumbens)、菠菜(Spinaciaoleracea)、反枝苋、凹头苋(Amaranthusblitum)、头状藜和藜麦(Chenopodiumquinoa)。随后BARR等[8]首次发现P.betae能够侵染白麦瓶草(Silenealba)和草地滨藜(Atriplexpatula)。1994年,在研究P.graminis对谷类作物的侵染性时偶然发现P.betae能够侵染特定品种的燕麦(AvenasativaL.cv.Peniarth),这是首次发现P.betae可以侵染单子叶植物[9]。HUGO等[10]在花椒罂粟(Papaverargemone)、虞美人(Papaverrhoeas)、狗筋麦瓶草(Silenevulgaris)、夜花蝇子草(Silenenoctiflora)、禾叶繁缕(Stellaria graminea)、甜菜(B.vulgaris)、菠菜、杂配藜(Chenopodiumhybridum)、Chenopodiumbonus-henricus、Chenopodiumpolyspermum以及Amaranthuscaudatus-viridis的根中观察到了P.betae的休眠孢子囊,但只有从甜菜、菠菜和Chenopodiumpolyspermum上分离得到的P.betae才能将BNYVV传播到甜菜上。2008年,MOUHANNA等[11]在甜菜丛根病发生的土中种植的大穗看麦娘(Alopecurusmyosuroides)、多花黑麦草(Loliummultiflorum)、高粱(Sorghumvulgare)、石茅(Sorghumhalepense)、旋花(Calystegiasepium)、荠菜(Capsellabursa-pastoris)、矢车菊(Centaureacyanus)、田旋花(Convolvulusarvensis)、牛膝菊(Galinsorga parviflora)、无香母菊(Matricariainodora)、繁缕(Stellariamedia)的根中观察到了休眠孢子囊,通过RT-PCR验证其为P.betae而非P.graminis。2011年,DESOIGNIES等[12]发现P.betae能够侵染拟南芥。2013年,SMITH等[13]意外地在小麦根部上也检测到P.betae。近年来,有学者发现P.betae能够侵染甘蓝(Brassica oleracea)、萝卜(Raphanussativus)、野萝卜(R.raphanistrum)以及大爪草(Spergulaarvensis)[14-15]。

表1 甜菜多黏菌寄主范围Table 1 The host range of P.betae

4 甜菜多黏菌的培养体系

P.betae专性寄生,至今仍无法通过人工培养基培养。1989年,TAMADA[16]用1/5的Hoagland营养液和Arnon溶液(102 mg/L KNO3、136 mg/L KH2PO4、236 mg/L Ca(NO3)2·4H2O、48 mg/L MgSO4·7H2O、0.001 mg/L Fe-EDTA、0.6 mg/L H3BO3和0.4 mg/L MnSO4·4H2O,pH 7.0)在石英砂中培养甜菜建立砂培体系,成功繁殖了带毒的P.betae。1995年,彭日荷等[17]用该营养液浇灌种植于河砂中的甜菜,通过将新鲜病根、干病根或病土埋入砂中、新鲜病根汁液浇灌、游动孢子接种等方法成功繁殖了P.betae,其中,病土和新鲜的病根接种15 d后才能观察到休眠孢子,而干病根、新鲜病根汁液和游动孢子接种后7 d就能观察到休眠孢子;观察到P.betae从新鲜病根中释放出来也会受到阻力,推测复杂的根际微生物对P.betae的侵染有一定的拮抗作用,所以相比于干病根、病根汁液和游动孢子接种,新鲜病根和病土接种出现了休眠孢子滞后现象。2011年,DESOIGNIES等[18]将P.betae接种在无菌培养的甜菜毛状根上,于液体培养基中培养,通过光学显微镜和共聚焦显微镜观察到了P.betae的典型结构,并且PCR检测呈阳性,成功建立了P.betae的半体外培养体系。

5 甜菜多黏菌的基因组

DECROËS等[19]用P.betae单孢子菌株A26-41(休眠孢子团聚集型)的游动孢子接种3周龄的单粒甜菜DH(double hapliod)系‘KWS2320’,培养14周后对根进行表面消毒,用CTAB法提取DNA,首次获取了P.betaeA26-41的全基因组序列,基因组组装由1 001个重叠群表示,累积长度为27 085 946个核苷酸。之后该课题组又通过元基因组学从未经纯化的游动孢子组装了RES F41分离物的核基因组以及线粒体基因组,并提供了P.betae基因组的完整注释[20]。比较发现RES F41和A26-41两个分离物的核基因组高度相似,均包括约10.2 k的预测编码基因,其中约3%是每个分离物所特有的。同时将P.betae基因组与芸薹根肿菌(Plasmodiophorabrassicae)和马铃薯粉痂菌(Spongosporasubterranea)进行比对,尽管三者属于同一个科,并拥有相似的生活方式,但它们拥有一些特异表达的蛋白。如与二者相比,P.betae含有锚蛋白重复结构域(ankyrin-repeat domains,Anks)的蛋白丰度更低,在P.betae中检测到了3种含有信号肽的类PR-4蛋白,而在Plasmodiophorabrassicae和S.subterranea中未检测到;Plasmodiophorabrassicae编码作用于植物水杨酸的甲基转移酶基因PbBSMT和生长素响应基因PbGH3,而P.betae和S.subterranea并不编码这些基因,且Plasmodiophorabrassicae在G蛋白偶联受体的信号通路(G protein coupled receptor signaling pathway,GPCR)中相关基因的表达量远高于P.betae和S.subterranea,这些基因参与细胞外环境信号和寄主细胞内信号识别[20-22];在P.betae和S.subterranea中检测到了CatSper(sperm-specific voltage-gated calcium channel)复合主体(α1-4)和辅助亚基(βδγ)的同源物,推测钙离子信号通路可能在P.betae和S.subterranea生活史中发挥着关键作用,这些差异预示三者可能通过不同的策略,依赖于不同的关键分子机制入侵寄主的根细胞并繁殖[20]。

6 甜菜多黏菌的诊断与检测技术

6.1 显微镜观察

最初只能通过光学显微镜和透射电镜观察P.betae的不同形态以确定甜菜是否受到侵染[5,23-26],但由于从形态上难以区分P.betae和P.graminis,且难以制备合适的样本用于观察,因此科学家们开始尝试用其他方法来检测P.betae。

6.2 分子检测

1994年,通过对ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列的限制性内切酶分析,首次成功区分P.graminis和P.betae[27]。随着PCR检测快速兴起,相比光学显微镜观察,PCR检测假阳性更低,且耗时减少,操作更加简单便捷,逐渐成为P.betae检测的主要技术[28-29],同时巢式PCR、实时PCR、Northern印迹杂交和斑点印迹杂交技术也逐步用于P.betae的检测[28,30-32]。WARD等[33]使用EDTA裂解缓冲液、DNA提取试剂盒以及磁珠从土壤中直接提取了P.betae的DNA,结合实时荧光PCR和TaqMan技术从有丛根病危害的土壤中检测到了P.betae,这是首次直接从土壤中检测到P.betae。随后一种快速从少量土壤(1.5 g)中同时提取RNA和DNA的方法,也应用于土壤中P.betae和BNYVV的检测[34]。

6.3 血清学检测

MUTASA-GOTTGENS等[35]通过cDNA文库筛选,获得编码P.betae特异性谷胱甘肽S转移酶蛋白(glutathione-S-transferase,GST)的cDNA,表达纯化该蛋白制备的抗血清能够特异性检测P.graminis和P.betae,2003年KINGSNORTH等[36]在MUTASA-GOTTGENS的基础上,建立了一种基于ELISA的多克隆抗体的检测方法,此后ELISA广泛用于P.betae的田间检测。

7 甜菜多黏菌与病毒及寄主的互作

1964年KESKIN等[23]发现甜菜丛根病的发生与P.betae有关,1973年TAMADA[37]证明P.betae传播的BNYVV为丛根病的病原。P.betae持久性传播BNYVV,其休眠孢子在土中至少可生存15年[38]。

TAMADA等[39]通过S0(RNA-1+2)的17代机械接种获得了2种通读蛋白部分缺失的RNA2突变体RNA-2a和RNA-2b,并用分别含有这2种突变体的P.betae(S-0a和G-0b)进行传毒实验,发现只有野生型突变体S0能够传播,而突变型不能传播,且含有RNA3和RNA4的突变型依旧不能传播,因此推测RNA2编码的通读蛋白在P.betae传播BNYVV的过程中发挥着重要的作用,为了更好地确定RNA2通读蛋白上与菌传相关的区域,又构建了一系列的C端丙氨酸扫描突变体,确定KTER基序与菌传效率密切相关[40],P.graminis传播的SBWMV的通读蛋白上也存在类似的基序[41]。

LEMAIRE等[42]利用不同RNA组分的BNYVV分离物,通过P.betae接种甜菜发现,不含有全长RNA3和RNA4的病毒分离物传播效率低,而能够成功侵染甜菜的分离物具有全长RNA3和RNA4,说明在自然侵染条件下,RNA3和RNA4影响P.betae传播BNYVV的效率。TAMADA等[43]却认为RNA3和RNA4在P.betae传毒过程中发挥着不同的作用。他们利用S0、S3(RNA-1+2+3)、S4(RNA-1+2+4)、S34(RNA-1+2+3+4)四个不同的分离物,用P.betae对甜菜进行传毒实验,发现S34的传毒效率远高于S4,且被侵染的根中病毒含量更高,S4的传毒效率远高于S3,S0的传毒效率极低;而这些分离物在机械接种局部寄主番杏时,S4和S0在接种叶中增殖情况无差异,说明S0的传毒效率低下不是由于病毒增殖能力降低而引起的;当用稀释过的P.betae接种甜菜时,S3侵染的根中病毒含量高于S4和S0,说明RNA3影响病毒在根中的繁殖,而与传毒效率无关,决定传毒效率的是RNA4,RAHIM等[44]用O11-3(RNA1+2+3)、O11-4(RNA1+2+4)、O11(RNA1+2+3+4)及其RNA4突变体接种大果甜菜也得到了相似结论。RAHIM和韩成贵等[44-45]用BNYVV RNA4侵染性克隆构建系列编码框突变体,通过传毒实验证明RNA4编码区各种缺失突变体都显著抑制P.betae的传播,说明RNA4编码的p31蛋白对于P.betae的传播是必需的。

P.betae不同寄主专化型携带或传播BNYVV的能力也存在差异,分离自藜、反枝苋和马齿苋的P.betae专化型既无法侵染甜菜,也不能携带BNYVV;带毒甜菜专化型P.betae在侵染小藜后可脱毒成为无毒菌株,而当这些无毒P.betae重新从感染BNYVV的甜菜植株获毒后可以再次传播病毒[38]。通过免疫金标记技术发现RNA3编码的p25和RNA4编码的p31是病毒唯一定位于P.betae游动孢子细胞核中的蛋白,很有可能在传毒中发挥着积极的作用;同时,研究发现病毒在P.betae内滞留超过了一个生命周期,因此推测P.betae不仅仅是BNYVV的传播介体,也很有可能是病毒新的宿主[4]。

转录组分析发现,当无毒的P.betae侵染甜菜时,大部分防御相关基因表达下调,例如:抗性基因类似物(resistance gene analogues,RGA)、转录因子、细胞壁过氧化物酶家族,而参与氧化还原动态平衡的基因表达上调,如谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GSTs)。当带BNYVV的P.betae侵染甜菜时,P.betae生活史的第一个阶段明显加快,且植物防御通路基因、病程相关蛋白、与细胞壁完整性相关基因以及酚类化合物的合成上调。表明甜菜与P.betae为共生关系,BNYVV能够促进P.betae的侵染从而达到快速传播的目的[46]。

8 综合防治方法

8.1 农业栽培防治

P.betae在pH 5.5～8.5侵染性较强[15],pH不会影响休眠孢子的存活,但是酸性环境能够抑制孢子的萌发,降低游动孢子的游动和存活率,因此可以通过调节土壤pH达到防治的目的,但同时也要注意作物适宜的pH[47]。由于P.betae的休眠孢子可以在土壤中存活多年,因此轮作非常必要,轻病田4年以上轮作,重病田7年以上轮作。

低温不利于P.betae的侵染,因此可以提前播种期,避开敏感期。培育壮苗,增强植株的抗病能力也能起到一定的防治作用[48-49]。同时要做好农具机械消毒工作,拔除并焚烧病株,控制病原传播以及土壤中孢子的含量[50]。另外,做好病虫害的防治工作,及时中耕、除草、间苗定苗,及时追肥浇水、保证灌水质量,保持田间不积水,地块通风,营造良好的生长条件,增强植株自身的抗病能力,但同时也要注意灌溉的时期以及排水,防止土壤水分饱和及土壤温度升高刺激游动孢子的萌发和释放[47]。

8.2 化学防治

用甲基溴、1,3-二氯丙烯或甲胺咪唑钠等对甜菜田进行土壤熏蒸可以显著减少病害,提高产量,但该方法成本较高以及会对环境产生不良影响,因此不适合大规模的使用[47,51-52]。

8.3 抗性品种

具有P.betae抗性的甜菜资源主要包括滨海甜菜(Betamaritima)、白花甜菜(B.corollinae)和碗状花甜菜(B.patellares)[53]。滨海甜菜对P.betae的抗性属于数量遗传,尽管这能增加抗性保持时间,但对抗性品种的选育带来了困难[54]。P.betae游动孢子侵染甜菜后,休眠孢子堆在感病品种根部的表皮细胞中大量形成,在抗性甜菜中,游动孢子能够穿透根部表皮,但是很少观察到进一步扩散,以及形成休眠孢子[55-56],通过单体附加系的研究,证明诱导休眠孢子形成的基因位于寄主植物的IV和VIII染色体上[57]。2009年ASHER等[58]从100多份野生甜菜种质资源中筛选出了2个抗P.betae的基因,定位于IV和IX染色体上,分别命名为pb1和pb2,在回交子一代群体中,对P.betae和BNYVV的抗性QTL共定位在染色体IV上,表明对丛根病的抗性受传播介体抗性的影响,这与之前BARR等人观察到的现象是一致的[55]。抗BNYVV基因已在高产的甜菜品种中广泛运用,但目前已出现抗病品种“抗性丧失”的报道[59-60],未来pb1/pb2将会给甜菜抗性育种带来新的可能性。

8.4 生物防治

2003年,王琦等[61]从甜菜丛根病重病田的轻病株根面和根内分离得到了26个放线菌,其中3个链霉菌属(Streptomyces)分离物可以拮抗P.betae,其代谢液能够抑制P.betae休眠孢子的萌发,使游动孢子游动减缓。芽孢杆菌分泌的环状脂肽能够诱导甜菜产生系统抗性从而增强对P.betae的抗性[62]。此外,恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、篮状菌(Talaromyces)和木霉(Trichoderma)也能降低P.betae的种群数量[63-64]。

9 讨论与展望

多黏菌本身对寄主植物的影响较小,但由于其常作为病毒介体传播病毒,对甜菜、小麦以及其他寄主存在着巨大的威胁。多黏菌属目前包括2个种,其中P.graminis传播至少15种病毒,包括土传小麦花叶病毒(soil-borne wheat mosaic virus)、小麦梭条花叶病毒(wheat spindle streak mosaic virus)、小麦黄花叶病毒(wheat yellow mosaic virus)、水稻条纹坏死病毒(rice stripe necrosis virus)[65]。P.betae除了传播BNYVV之外,同时它也能传播甜菜土传花叶病毒、甜菜土传病毒和甜菜Q病毒,这3种病毒偶尔会与BNYVV复合侵染甜菜[1]。

P.betae和P.graminis从形态上难以区分,WARD等[29,66-67]通过ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列成功地区分了P.graminis和P.betae。进一步根据rDNA序列将P.graminis分为5个核糖型,同时有研究表明温度和寄主范围等生态特征与核糖型之间存在一定的联系[68]。LEGRÈVE等[69]根据生态特征以及ITS序列将P.graminis分为了5个专化型:P.graminisf.sp.temperata、P.graminisf.sp.tepida、P.graminisf.sp.tropicalis、P.graminisf.sp.subtropicalis以及P.graminisf.sp.colombiana,这5个专化型与WARD和MORALES等提出的5个核糖型Pg-I、Pg-II、Pg-IIIaorb、Pg-IVaorb以及Pg-V相对应。陈建平[70]团队分析了被土传小麦病毒侵染的小麦根部P.graminis的核糖型,发现中国传播土传小麦病害的P.graminis属于核型Ib(Pg-Ib)的一个亚支,也可能属于核型IIa(Pg-IIa)。然而目前关于P.betae遗传多样性的研究还较少,前人试图根据ITS区域分析P.betae的遗传多样性,但均发现P.betae在ITS区并没有多态性,因此通过比较基因组学寻找更精确的基因标记(genotyping markers)以明确P.betae的遗传多样性对于推动P.betae的研究具有重要意义。此外,当BNYVV存在时,P.betae生活史的第一个阶段会加快,从而促进病毒的侵染速度,植物抗逆基因表达水平上调[46],若能明确其中的机制,对于抗性品种培育具有指导意义。