白腐菌与厌氧污泥共培养强化秸秆湿式厌氧发酵

袁文典, 于麒麟, 张耀斌

(大连理工大学 环境学院 工业生态与环境工程教育部重点实验室, 辽宁 大连 116024)

0 引 言

在我国农业向规模化、专业化发展的道路上,农作物秸秆和畜禽粪便等废弃物的处理成为农业前进的桎梏。根据农业农村部2022年的数据,我国仍有8 700万吨左右的秸秆未能有效利用[1]。厌氧消化技术因其能耗低、能量转化率高,除能生产清洁能源沼气外,发酵的残余物沼液、沼渣还可用作有机肥等优点,已成为农业废弃物能源化利用的重要技术路线,是实现我国“双碳”目标的重要手段之一。秸秆类生物质主要成分包括32%～47%的纤维素、19%～27%的半纤维素和5%～24%的木质素[2]。然而目前以木质纤维素作原料的湿式发酵水处理技术仍有一些难题,如以木质素为主体的框架阻碍微生物对于秸秆的分解利用,发酵次产物限制微生物种间电子传递等[3]。当前,国内外的主要解决办法仍以预处理为主,如通过蒸汽爆破、酸碱预处理、真菌预处理、酶发酵等物化生手段,使秸秆改性或易利用组分暴露,从而实现后续厌氧消化的高效运行[4]。然而由此产生的人力、物力与时间空间成本,制约了秸秆湿式厌氧消化技术推广。

自然环境中,白腐菌是秸秆、树木木质素的主要分解者。在氧气参与下,白腐菌氧化辅酶产生过氧化物,进而在多种过氧化物酶的作用下,进攻木质素的苯环并产生苯氧自由基,诱发木质素裂解[5]。大量研究表明,真菌利用氧气降解木质纤维素时伴随有醌基氧化还原循环和腐殖质形成[6]。GRINHUT等指出白腐真菌可以促进分解和矿化一些较难腐解的有机物[7]。CHEN利用黄孢原毛平革菌腐熟秸秆并研讨不同时间段对堆肥情况的影响,发现在腐熟过程中,碳氮比降低而腐殖化程度升高[8]。大量研究报道,腐殖质由于醌基的存在,可以作为电子穿梭体,增强产甲烷菌群的胞外电子传递[9-10]。此外,氧气也常是促进难分解底物厌氧消化的一种手段,有研究报道微好氧下秸秆厌氧发酵效果有所提高[11]。

此外,白腐真菌的种类繁多,绝大部分为担子菌,少部分为子囊菌,其对木质素的降解通常有两种形式:选择性和非选择性。在选择性降解中,较难被利用的木质素可以被优先降解,而易被利用的纤维素和半纤维素部分几乎没有发生降解;非选择性降解中,木质纤维素生物质所有部分同时发生降解。TANIGUCHI等发现,在其研究的菌株中(P.chrysosporium、C.subvermispora、Trametesversicolor、Pleurotusostreatus),P.chrysosporium(黄孢原毛平革菌)在选择性降解木质素成分方面最成功,而更高的选择性也意味着可生化性的最大保留,能为后续产甲烷菌群留存更多营养物质[12]。

因此,本研究在传统湿式厌氧消化体系中引入黄孢原毛平革菌(后称白腐菌),在微氧条件强化秸秆悬浮液湿式发酵,同时,通过分析共培养体系的代谢过程,探究在不经预处理下木质素底物甲烷化的效果与可行性。

1 实验方法与材料

1.1 实验材料

接种污泥取自大连某污泥处理厂的厌氧污泥消化罐,污泥含固率约为15%。使用20目筛网将污泥过筛后,用人工废水活化一周后备用,活化后部分指标见表1。人工废水采用葡萄糖为主要碳源(COD浓度为5 000 mg/L),NH4Cl和KH2PO4作为氮源和磷源(COD∶N∶P=200∶5∶1)。使用酵母浸粉作为维生素和微量元素补充剂,浓度约0.4 g/L。采用NaHCO3调节初始pH为7.0～7.2。秸秆收集自江苏连云港附近某玉米农田,机械粉碎后过100目筛,阴凉干燥处保存备用,秸秆部分物性参数见表2。黄孢原毛平革菌购自北纳生物河南省工业微生物菌种工程技术研究中心,使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化,在30 ℃培养5 d后,使用无菌水冲刷刮取菌落获得孢子悬浊液,稀释至OD600测量值为1.0,加入甘油至比例为30%,-20 ℃保存用作后续实验接种。

其余实验试剂均购自上海麦克林生化科技股份有限公司。

表1 实验厌氧污泥初始指标

1.2 实验设置

实验采用半连续模式。在500 mL的双通丝口瓶中进行,加入50 g厌氧污泥,加去离子水使最终体积为500 mL。两通一出口连接气袋采集气体,另一出口连接软管收集实验固液混合物。在实验第0天与第6天向实验组投加1 mL上述接种孢子悬浮液,向对照组投加1 mL灭菌后孢子悬浮液。每组设3个平行。实验设置水力停留时间(HRT)为30 d,每3 d取样50 mL,并补充底物进水。取样时振荡摇匀后用作后续分析检测。配置底物进水采用秸秆作为唯一碳源,NH4Cl和KH2PO4作为氮源和磷源,浓度分别控制在40、2、1 g/L。采用NaHCO3调节进水pH为7.0～7.2,同时曝N2控制溶解氧在0.6 mg/L。放入37 ℃恒温房(专门用作恒温培养的房间)中进行厌氧消化,以一个水力停留时间段为一个周期,运行2个周期。

表2 实验秸秆物性参数

1.3 分析方法

实验部分指标测定方法及仪器详情见表3。实验中多糖、蛋白质常规指标测定参照水和废水监测分析方法(第四版);COD的测定方法:取摇匀后的固液混合物,直接测量总体的COD为TCOD,离心后(8 000 r/min,10 min)取其上清液的COD为SCOD,测量仪器为COD快速测定仪,所用试剂为硫酸-硫酸银和重铬酸钾;TS和VS用质量法测定;气体体积用注射器测定,气体成分及占比通过气相色谱分析;采用电化学工作站循环伏安法(CV)测定污泥的电容性或充放电能力(铂电极为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂电极为对电极)。

三维荧光光谱(EEM)分析使用Agilent Cary Eclipse荧光分光光度计分析,激发波长Ex=190～560 nm,发射波长Em=230～600 nm,激发和发射波长的狭缝宽度均为10 nm,激发和发射波长的扫描间隔分别为2、5 nm,扫描速度为1 200 nm/min。

红外分析时,泥样放入冷冻干燥机中,加盖冷冻干燥20 h,冷冻干燥条件:压力1.0 Pa,温度-54 ℃。采用Thermo Nicolet IS50高级傅里叶变换红外光谱仪,扫描范围4 000～400 cm-1,扫描32次,分辨率4 cm-1。

半连续实验结束后,收集实验组对照组反应器内的污泥样品,采用高通量16S rRNA的焦磷酸测序来分析微生物的群落结构。污泥样品的脱氧核糖核酸(DNA)利用土壤快速DNA提取试剂盒提取,随后分别对古菌和细菌的V3-V4与真菌的ITS区16S rRNA序列,区进行PCR扩增。汇集和纯化后的PCR产物采用IlluminaTruSeqDNA文库的制备方案进行构建并利用IlluminaHiseq2000测序仪进行测序。

表3 部分指标分析方法及仪器

2 结果与讨论

2.1 白腐菌共培养对厌氧发酵秸秆降解的影响

第1周期前10 d,实验组SCOD更高,最高达到1 200 mg/L(图1),这可能是由于白腐菌优先利用反应器中的微量氧气,从而减少污泥中兼性菌的耗氧分解,保留了更多的营养物质;而在后20 d中,实验组和对照组差异较小,SCOD上升缓慢,从373.2 mg/L增加到477.0 mg/L,而TCOD不断上升。这可能是秸秆液化困难,难以被利用,导致总有机物积累。其原因可能有二:(1)厌氧污泥难以利用秸秆,这与以往研究中厌氧发酵处理秸秆只有15%～25%的降解率相符[13];(2)反应器设计溶解氧量0.6 mg/L,白腐菌在氧气不足时增殖缓慢,因此在实验初期(1～30 d),实验组与对照组并没有表现出较大差距。

第2周期实验组对秸秆的降解效果明显优于对照组。从第31天开始,实验组表现出在TCOD和SCOD上的差异,并且差异逐渐扩大。实验45 d后差异逐渐稳定,此时实验组TCOD去除率为36.7%,较对照组(27.4%)提高了34.7%。同时,实验组SCOD((830.6±1.6)mg/L)也比对照组((734.7±17.2)mg/L)提升13%。未投加白腐菌时,厌氧菌群可能利用秸秆结构中侧链裸露的多糖纤维素进行厌氧发酵[14]。此外有研究报道,厌氧肠道微生物也可降解部分秸秆木质素,降解率一般在23%～37%,这与对照组TCOD的降解率相符[15]。投加白腐菌后,实验组白腐菌繁殖并利用微量氧气裂解秸秆中木质素复合体,从而使更多纤维素、半纤维素等易利用组分暴露,促进其降解。这与自然情况下白腐菌对于木质素降解规律相符。此外,实验组秸秆降解率在第42天后难以继续提高,可能原因是氧气不足。

图1 厌氧发酵混合物有机物浓度变化曲线Fig. 1 Concentration change curve of organic mixture in anaerobic digestion

2.2 白腐菌共培养对厌氧发酵产甲烷的影响

第一个周期的前20 d,实验组累计产生了511.5 mL甲烷,略高于对照组(470.9 mL)。效果仅微弱提升可能是由于部分秸秆在白腐菌增殖过程中被分解利用,但总体由于白腐菌正处于从孢子向菌丝体转变的增殖阶段,与实验组差异较小。24 d后,实验组产甲烷性能与对照组表现出差距,甲烷日产量不断提高(图2(a))。45～60 d,实验组平均日甲烷产量为(109.7±8.3) mL,底物甲烷产率为75.76 mL/g VS,较对照组((75.6±6.2)mL、52.21 mL/g VS)提升了45%。

图2 甲烷产量曲线Fig. 2 Methane yield curves

甲烷产率提高比例高于降解率的提高比例,推测是由于白腐菌除了通过分解秸秆提供额外的营养物外,还利用了其他途径刺激产甲烷过程。可能的原因为白腐菌降解木质素的代谢产物更好地促进了产甲烷体系的代谢途径。根据GUILLéN的研究,木质素经白腐菌代谢后产生的产物中醌基的含量提高,而醌基则作为电子穿梭体的核心官能团可加快产甲烷菌群的胞外电子传递,进而促进产甲烷代谢,提高甲烷产量[16-17]。本文2.4节将进一步测定醌基的相对含量。由甲烷累计产量(图2(b))可知,实验组在60 d运行中累计产生1 750.5 mL甲烷,而对照组累计产生了1 279.3 mL甲烷,提高了36.8%。

2.3 电化学测量循环伏安曲线

图3显示了共培养污泥的循环伏安曲线(CV)测量结果。图3(a)是初期污泥与实验结束后实验组和对照组的污泥电活性测量结果。图中非线性可逆氧化还原电流是污泥电活性组分由于充放电过程引起的,而循环伏安曲线的积分面积对应共培养污泥的电容[18]。

图3 共培养污泥的循环伏安曲线Fig. 3 Cyclic voltammetric curves of co-cultured sludge

实验末期共培养污泥所对应的氧化还原电流最大,为7.44 μA/cm,其比电容也最大8.26×10-5F,初始污泥和末期对照组污泥2个样品的最大电流值与比电容分别为2.64 μA/cm与4.64×10-5F和2.00 μA/cm与2.92×10-5F。在电容方面,实验末期污泥相较于实验开始时提升了78.0%,相较于对照组提升182.9%。推断出,白腐菌与污泥共培养有助于污泥的电容提高,并可能参与促进胞外电子传递。相较之下,对照组电容反而减小,可能是污泥原有电活性物质的流失造成的,也与上文对照组末期甲烷产量不佳的表现一致。

此外,实验组循环伏安曲线出现了明显的氧化还原峰,氧化峰位于0.478 mV,还原峰位于-0.571 mV。从图3(b)观察,总体上峰型对称,且在不同扫描速度下氧化还原峰位置不变,说明实验组末期污泥中存在可逆的氧化还原物质,存在白腐菌通过代谢产生电活性物质促进厌氧产甲烷的可能性。根据氧化还原峰电位以及两者差值推测可能归类于腐殖质[9,19-20]。此外,在20 mV/s的扫速下,反扫过程还原峰与氧化峰并不对称,说明污泥中存在不可逆的还原性组分,这可能与木质素代谢产物相关。

2.4 傅里叶红外透射检测

图4 共培养污泥红外透射图谱Fig. 4 Infrared transmission spectra of co-cultured sludge

根据以往对于白腐菌降解木质素的代谢过程的相关研究,白腐菌的过氧化物酶利用过氧化物基团进攻木质素的苯环,促使其向苯氧自由基转变,进而诱发苯环的裂解。同时由3种单体对羟基苯基(p-hydroxyphenyl, H)、愈创木酰(Guaiacyl, G)和紫丁香酰(Syringyl, S)构成的木质素,存在大量的醚键,一般分为β-O-4型、β-β型、β-5型,又以β-O- 4型为主要连接方式[21]。白腐菌的多种过氧化物酶可作用于这些醚键,解除木质素复合体的交联。因此从红外图谱中可以看到,相较于对照组,实验组醚键振动峰的信号有所下降,说明木质素复合体中醚键断裂,交联结构分解;同时1 650 cm-1处峰值的提高说明醌基组分提高,这与白腐菌降解木质素时会形成醌类物质的研究相一致。KAWAI等的文章中报道了漆酶能将β-1型木质素分解形成2,6-二甲氧基-1,4-苯醌,这也与循环伏安检测的结果一致[22]。

2.5 三维荧光光谱分析

对不同天数的实验组和对照组污泥进行三维荧光光谱(EEM)表征,如图5所示,从上至下分别为0、20、40和60 d的结果。根据CHEN等的研究,EEM谱图可分为5个区域(表4)[23]。已有研究表明,黄腐酸类物质(区域Ⅲ)与腐殖酸类物质(区域Ⅴ)相比,分子质量相对较低,芳香度和氧化程度上都弱于腐殖酸,但在生物可利用性上表现更好[24]。

图5 实验各阶段污泥EEM谱图Fig. 5 EEM of sludge at various stages of the experiment

表4 EEM谱图区域划分及代表物质

随时间推移,总体趋势为从代表芳香性蛋白组分的Ⅰ、Ⅱ区向代表腐殖质的Ⅲ、Ⅴ区转化;而与微生物代谢产物相关联的Ⅳ区的整体荧光信号是减弱的;也注意到前20 d中,代表腐殖酸的Ⅴ区的荧光信号都有不同程度的下降。在这一段培养期间,一方面污泥中携带的有机物在不断被消耗,代谢产物不断向腐殖质转变;另一方面污泥世代时间短于水力停留时间,导致了生物量的下降,微生物代谢产物浓度降低。

以实验组与对照组之间的对比分析,差异表现在两方面:一方面,运行时实验组代表黄腐酸类物质的Ⅲ区荧光信号显著高于对照组,意味着实验组确实有更多的黄腐酸类物质生成,白腐菌刺激了底物腐殖化;另一方面,运行20 d后,代表腐植酸类物质的Ⅴ区,只在实验组中出现荧光信号强度回升,代表腐殖质物质又有所增加。根据已有研究表明,白腐菌确实参与了自然界中的腐殖化过程。根据PAUL等的研究,白腐菌可以加速堆肥腐殖化,能以植物残体中的木质素降解产物为骨架,先缩合形成黄腐酸,之后芳香度不断提高向腐殖酸方向演化,这与实验组EEM谱图的变化过程是一致的[25]。对照组因为难以将秸秆液化,厌氧消化和腐殖化过程缓慢。

2.6 微生物群落分析

取运行结束实验组污泥进行16S rRNA鉴定,在属层面进行分析(图6)。

图6 实验组末期污泥微生物丰度图Fig. 6 Plot of microbial abundance at the end of the experimental group

在真菌层面分析显示,投加的P.chrysosporium占有真菌相对丰度的5.8%,说明黄孢原毛平革菌确实在共培养体系中稳定存在。污泥中占主导地位的是Tarzetta,其相对丰度为60.8%,根据HYDE等的研究表明该菌可以腐殖化朽木,同时与脲酶的活性有显著的正相关[26-27];其原因或许是共培养体系胞外酶降解发酵形成了尿素,为该细菌提供了代谢底物。

在古菌层面,占主导地位的是Methanothrix与Conexivisphaera菌,其相对丰度分别为41.0%与36.8%。据报道,Methanothrix主要以乙酸裂解途径产生甲烷,此外Methanothrix有种间直接电子传递(DIET)能力,在互氧代谢中可以借助DIET利用有机物产甲烷[20],而Conexivisphaera菌是一种嗜酸嗜热古菌,并且具有硫铁还原能力[28]。这2种菌的大量存在说明污泥中存在围绕胞外呼吸的微生物活动,很可能存在DIET过程[29]。

在细菌层面,Levilinea是占主导地位的菌属,相对丰度为27.1%。其与相对丰度占比为6.7%的Longilinea菌属经常被一起提及,归因于它们降解喹啉和吲哚的能力[30]。同时Levilinea也作为丙酸盐氧化细菌与Methanothrix配合一起被报道,推测共培养体系并非以短链挥发性脂肪酸为主要底物进行厌氧产甲烷,而是以木质素开环后形成的长链脂肪酸为底物。这些细菌菌属丰度的提高,有利于共培养菌群降解秸秆代谢产物中含氮杂环类物质。

3 结 论

本研究将黄孢原毛平革菌与传统厌氧污泥在微氧情况下共培养,实现了在不经预处理情况下对秸秆木质素湿式发酵利用,证明了共培养体系的可行性。一方面,通过在微氧下构建白腐菌和产甲烷菌复合菌群,形成了新的共培养污泥群落,同时促进了秸秆的液化、腐殖化;另一方面,白腐菌对秸秆的木质素复合体的解聚开环中形成的大量醌基和类腐殖质物质有助于产甲烷菌群的胞外电子传递过程,推动了厌氧产甲烷。然而,黄孢原毛平革菌引入后群落的代谢仍需要进一步研究,特别是氧气参与下木质素的解聚与腐殖质的形成机理和细菌古菌与真菌的互作共生机制仍不充分。这些发现有望为木质素的高效生物精炼利用提供参考信息。