基于网络药理学探讨白芍治疗阿尔茨海默病作用机制*

曾庆涛，吴红彦△，王雅乐，王 斌，黄 海，王虎平

1 深圳市罗湖区中医院，深圳 罗湖 518000； 2 甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一种慢性退行进行性神经性疾病，其临床特征主要表现为认知功能下降，发病初期偶有记忆障碍。研究发现，AD 主要是因为β淀粉样蛋白（βA）的长期积累和Tau 蛋白的高磷酸化，导致淀粉样斑块和神经纤维缠结形成［1］，从而发病。据流行病学调查显示，全世界共有4000万人罹患AD［2-3］。

白芍为毛茛科植物芍药（Paeonia lactifloraPall.）的干燥根，主产于浙江、安徽等地。白芍味苦、酸，性微寒，归肝、脾经，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳等功效。研究表明，白芍含有鞣质类、单萜类、黄酮类、多糖和三萜类等成分，具有抗炎、抗氧化、保肝、镇痛等药理作用［4］。

基于中药网络药理学软件的整体性，系统性、多向性等特点，本次研究以白芍为主，构建“成分-靶点-通路-疾病-机制-AD”复杂络图［5］，以便阐释白芍多成分-多靶点-多通路等特点，进一步探究白芍治疗的AD具体作用机制。

1 资料与方法

1.1 活性成分筛选利用中药系统药理学数据库和分析平台［6］（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），对白芍所有有效成分进行挖掘。由于有效成分众多，以药代动力学参数［7］为依据，设置选择条件，将口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，药物类似度（drug-likeness，DL）≥0.18设为筛选条件［8］。筛选后的有效成分为研究对象。

1.2 活性成分靶点的获取运用TCMSP 数据库平台，利用蛋白质数据库UniProt（http：//www.uniprot.org/），限定物种为“human”的UniProt KB数据，利用perl语言校正预测的靶点名称。

1.3 疾病相关靶点基因获取利用人类在线孟德尔遗传数据平台（OMIM，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）查找AD的遗传成分，以“Alzheimer disease”作为关键词，检索AD 的相关靶点。合并两次检索的靶点，删除重复的靶点。运用R 语言获取白芍有效成分靶点和疾病靶点的交集，得到韦恩图。

1.4 药物-成分-靶点-疾病网络图的构建将白芍有效活性成分靶点和AD 相关的靶点取交集，获得的靶点即为白芍治疗AD 的关键靶点。利用Cytoscape 3.7.1 软件（http：//www.cytoscape.org）安装JAVA 软件，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图。图中节点（node）代表白芍药物有效成分与关键作用靶点；边（edge）代表药物、成分、靶点、疾病之间的连接。整个网络构建并展示了药物-成分-靶点-疾病之间的联系，通过该系统可以深入探究白芍治疗AD 的作用机制。设置好中介中心度和网络节点度值筛选条件，充分挖掘图中的核心节点。

1.5 构建PPI（protein-proteinInteraction）将白芍治疗AD 的潜在靶点输入STRING 数据库平台（https：//string-db.org）中，限定物种为“Homo Sapiens”，获取预测靶点，以TXT 文件保存。运用Cytoscape 3.7.1 软件，设置好相关条件，对PPI图进行相关网络化和可视化的优化处理［9］。点击软件中的Network Analyzer 插件进行网络分析，分析介度中心性、分析其度中心性及紧密度中心性等拓扑值。

1.6 GO注释及KEGG通路分析利用目前最常用的Bioconductor生物包，通过R 语言工具，输入相关生物包，便于分析GO注释信息。ClusterProfiler包是R 语言作为基因数据分析包之一，可搜索Bioconductor 提供的GO 注释信息和KEGG［10］数据库平台（http：//rest.kegg.jp/link/hsa/pathway），进行通路富集分析。运用上述软件，设置筛选条件以P＜0.05 为目的，进行信号通路富集分析，同时将富集分析结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 活性成分筛选运用TCMSP 软件平台筛选到白芍有效成分有110 个，以OB≥30%和DL≥0.18为限制条件进一步筛选，得到白芍的潜在的有效活性成分13个。见表1。

表1 白芍活性成分

2.2 白芍有效成分治疗AD 的潜在作用靶点预测通过GeneCards、OMIM平台搜索AD相关靶点合，并删去重复疾病靶点，运用R语言“VennDia-gram”程序包将与13 个白芍有效成分相关的靶点和疾病靶点取交集，获得白芍中有效活性成分治疗AD的靶点，同时绘制韦恩图。得到共同靶点60 个，表明白芍可调节多个靶点发挥治疗AD 的作用。见图1。

图1 白芍有效成分作用靶点及AD靶点交集

2.3 药物-成分-靶点-疾病网络图运用Cytoscape 3.7.1对白芍有效活性成分及其治疗AD 形成的作用靶点进行关系网络绘制和统计。经分析，白芍发挥重要作用的生物活性成分与对应作用靶点的相互关系见图2。中介中心度和网络节点度值揭示了节点在网络图中核心度的高低，度值越高，说明该节点在网络图中就越重要。本研究按Degree 值和BC 值大小排序筛选核心成分和靶点，结果显示，槲皮素、小檗碱、小檗红碱、（R）-卡纳丁、柏林滨、巴马汀、黄连碱、沃勒宁等靶点是整个网络的核心节点，揭示这些节点是白芍治疗AD形成的有效成分或靶点。见表2。

图2 白芍治疗AD形成的药物-成分-靶点-疾病网络

2.4 白芍治疗AD 形成的关键靶点利用PPI 网络分析登陆STRING 数据库平台，输入白芍有效活性成分治疗AD形成的靶点，设定置限制条件＞0.9，将独立于网络之外的蛋白予以排除，得到白芍有效活性成分对应的靶点PPI网络，见图3。网络图中的“节点”代表药物靶点，“边”表示靶点之间的相互作用关系。边数越多表示该节点对应的靶点在网络中的作用越重要。运用R 语言抽取网络中的关键靶点的信息条形图，见图4。结果表明，IL-6、JUN、PTGS2、CAPS3、MMP9、CXCL8、MYC、EGF 等蛋白的度值较高，说明这些蛋白在网络中的作用显著，是和其他蛋白互通的纽带。

图3 关键靶点PPI网络

图4 关键靶点信息条形图

2.5 GO生物功能及KEGG通路分析GO信号通路显示，白芍治疗AD 形成的关键靶点富集显著的前10 个生物学功能主要为受体配体活性（13 个靶点），细胞因子受体结合（12 个靶点），细胞因子活性（11 个靶点），血红素结合（9 个靶点），四吡咯结合（9 个靶点），内肽酶活性（9 个靶点），泛素样蛋白连接酶结合（8 个靶点），DNA 结合转录激活活性，RNA 聚合酶Ⅱ特异性（8 个靶点）等，表明白芍有效成分可通过调控多种生物学途径而发挥治疗AD的作用，见图5。运用KEGG通路富集分析，获取24条信号通路图，将P＜0.01 为筛选条件，得到有效4条信号通路。见图6。富集分析发现，基因显著富集在NF-kappaB（11 个基因）、AGE/RAGE（17 个基因）、IL-17（16 个基因）、TNF（16 个基因）等信号通路上。

图5 关键靶点基因生物功能注释信息

图6 关键靶点KEGG通路富集分析

3 讨论

经网络拓扑分析结果显示：berberine、berberrubine、epiberberine、（R）-Canadine、Berlambine、palmatine、quercetin、coptisine、Worenine 等为治疗AD 的主要有效成分。槲皮素属于黄酮类化合物其中之一，在植物中广泛存在。本研究主要是探讨木犀草素对认知功能是否具有保护作用，淀粉样β（Aβ）肽对大鼠的脑损伤及其相关作用机制。动物行为测试木犀草素能改善Aβ诱导的学习记忆障碍。木犀草素可以逆转乙酰胆碱酯酶活性的增加，还可使海马匀浆乙酰胆碱含量升高，丙二醛含量降低。木犀草素能提高Bcl-2/Bax 比值。这项研究表明，木犀草素可能具有治疗AD 的潜力［11］。小檗碱对转基因AD 小鼠的记忆、空间寻找能力有明显的改善作用，其作用机制可能与增加自噬水平LC3-Ⅱ调控Akt/mTOR 信号通路，同时增加PSD95 蛋白的表达水平及数量有关［12］。

KEGG 通路富集分析揭示，白芍治疗AD关键靶点基因显著富集在AGE/RAGE（17 个基因）、IL-17（16 个基因）、TNF（16 个基因）、NF-kappaB（11个基因）等信号通路上。刘继平等［13］通过对Western blot 进行观察发现，七福饮复方可以通过降低模型组SD雄性大鼠海马中AGEs的含量，下调大脑皮层和海马中RAGE受体和NF-кB信号通路上相关基因的表达，随着剂量逐步递增发现本方可逆转AGEs引起的IL-1β水平的升高。揭示了七福饮复方可抑制AGEs/RAGE/NF-KB 信号通路上相关基因的激活，可通过降低大鼠大脑炎症反应发挥治疗AD的作用［14］。

IL-17 信号通路，与炎症的发生有密切的关系，现已发现主要是由6个成员IL-17A、IL-17B等组成，IL-17 为受体家族，主要由5 个成员IL-17RA、IL-17RB 等组成。到目前为止，所有的IL-17 受体都招募Act1 作为下游信号传导的衔接分子。以神经内科住院患者104 例为研究对象［14］，研究发现AD患者体内IL-17表达明显升高。通过对IL-17 与认知功能评分的关系进行研究，发现在修正了年龄后，IL-17 与简易精神状态检查评分相关性不显著，而与认知功能检查量表评分有关联。

脑部疾病的发生一定程度上与炎症反应有关联。TNF超家族具有多种生理功能，可以调节神经系统的平衡。SHAMIM 等［15］研究发现，AD 胶质细胞一旦被激活后，将合成并同时释放大量TNF-α，更进一步诱导神经炎症反应，致复杂的神经元反应，促进了神经疾病的进展。在中枢神经系统中TNF-α引起的炎症反应可诱导β-淀粉样（amyloid-β，Aβ）蛋白斑块的沉积，而按照目前Aβ蛋白联假说，Aβ蛋白在脑细胞内外的积累可能促进了AD 的发展［16］。目前研究发现，在AD的发病过程中，免疫因子引起的慢性炎症也受到了重视，早期阶段TNF-α在参与免疫应答的同时启动炎症反应，诱导补体Aβ等的合成，作用于神经元和胶质细胞，影响神经的生长。

综上所述，本研究运用网络药理学初步筛选了白芍治疗AD 的有效成分，并阐释其作用机制，结果表明，在治疗过程涉及了多个有效活性成分、作用靶标及多个信号通路，其作用机制十分复杂，并非仅通过单个成分、作用单个靶标或调控单条通路发挥作用，与中药治疗疾病的多靶点、多通路特点相吻合。为进一步从白芍中提取有效活性成分治疗AD提供了参考。但从网络药理学层面，来探究白芍药物有效活性成分治疗AD的作用机制，只是一种理论性的探讨，仍需通过相关实验来验证。