草鱼肠系膜脂肪沉积量的测定与分析

姜 鹏， 樊佳佳， 李胜杰， 杜金星， 雷彩霞

(中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东 广州 510380)

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国重要的大宗淡水养殖品种，年供应量超过550万t[1]，为满足广大民众对优质动物蛋白的营养需求发挥着不可替代的作用。近年来，随着高产高效集约化养殖模式的推广，养殖草鱼长速加快，上市周期缩短，但也常出现体脂过度沉积现象[2]，导致鱼体自身健康状况及食用品质下降等问题[3-5]。尤其腹腔内的肠系膜脂肪组织，作为草鱼贮存能量，蓄积脂肪的主要功能部位[6]，过度沉积不仅造成饲料资源的浪费，也直接加剧肥胖体型，影响鲜活产品的销售[7-8]。

针对上述产业问题，科研人员尝试从营养与饲料、遗传育种等多方面开展调控机理与应用技术研究[2,9-11]。在研发过程中，通常涉及鱼体肠系膜脂肪沉积量的测定与比较，用于量化评价调控方案实施效果及优化技术参数。然而，草鱼腹腔内脂肪组织紧随肠管附着延伸，而草食性鱼类肠道细长，盘旋回折多，导致该性状难以直接计量。传统方法是利用解剖刀等工具将黏连在肠壁周围的脂肪组织进行人工刮取剖离，再集中称量分析。该方法虽然简单直接，但在实际操作时，易发生肠管破裂，使得肠道内容物混杂其中而导致数据出现较大误差。尤其当处理样品数量较多或实验鱼规格较小时，该方法存在耗时费力，操作失误率高，量化数据粗糙等问题。

为此，本实验拟利用脂溶性染料油红O可特异性着色脂肪的特性[12]，探索开发一种精确、便捷定量草鱼肠系膜脂肪组织含量的新方法，以满足研究实践需要；同时对测定数据进行统计分析，以评估度量性状的基本特征。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

实验所用草鱼取自中国水产科学研究院珠江水产研究所水产生物技术养殖基地。从正常饲养的养殖群体中随机挑选健康个体，体重范围约为75.0 ～ 95.0 g，数量200尾。所有实验鱼均出自同一批水花苗种，并在同一个池塘进行培育，以保证饲养环境条件的一致性。本研究获得了中国水产科学研究院珠江水产研究所实验动物管理和使用伦理委员会批准，实验过程中操作人员严格遵守伦理规范，并按照中国水产科学研究院珠江水产研究所伦理委员会制定的规章制度执行。

1.2 主要试剂与仪器

油红O干粉购自Sigma-Aldrich公司；无水乙醇(分析纯)购自天津市百世化工有限公司；多聚甲醛固定液(中性)购自武汉塞维尔生物科技有限公司；多功能酶标仪(型号Cytation-5)购自美国伯腾仪器有限公司；电子天平采用梅特勒托利多科技(中国)有限公司产品(精度∶1 mg；0.1 mg)。PIT电子芯片标记购自安徽瑞佰创物联科技有限公司。油红O染液的配置是按比例将1.0 g油红O干粉充分溶解于5.0 kg无水乙醇溶剂中，经300目滤网过滤后，密封备用。

1.3 性状测量与样品处理

麻醉后称量草鱼体重(BW)，并利用游标卡尺测量实验鱼体长(BL)、躯干长(TRL)、体高(BH)、尾柄高(CPH)和体宽(BWD)等体尺性状，然后解剖取出整个内脏团(不含鱼鳔、性腺)称取重量(VW)，摘除胆囊器官；将PIT 电子芯片塞入鱼肠道内，记录样品编码等信息，再把已标记的内脏团样品放入多聚甲醛固定液进行集中保存。待全部样品(内脏团)采集完毕，统一固定6 h；然后将固定样取出集中，加入适量无水乙醇试剂进行快速脱水操作，试剂需浸没全部样品，时长15 min；倒掉脱水废液，样品沥干2 min后，加入提前配置好的油红O染液进行染色处理，染液需浸没全部样品，时长9 min；倒掉染色废液，终止染色，样品沥干2 min后，加入适量无水乙醇进行快速漂洗，时长30 s；倒掉漂洗废液，样品沥干5 min后，将染色样品分别放入提前备好的加盖密封萃取瓶(含80.0 g无水乙醇试剂，其质量计为we)，进行28 h静置萃取；当萃取完毕，吸取1.6 ml萃取液至离心管，100000 r/min，离心1 min；再从中吸取200 μL上清液至酶标板，在波长510 nm处测定吸光度OD值，每个样品检测3次，取平均值。实验遵守本实验室的物伦理规范。

1.4 标准曲线的绘制

称量25.0 mg (精确到0.1 mg，下同)油红O固体粉末，充分溶解于约100.0 g的无水乙醇试剂中，配成油红O质量分数为250 μg/g的标准母液。定量吸取标准母液稀释于无水乙醇溶剂中，配成质量分数0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5 μg/g(以油红O质量计)的工作液，此标准溶液相当于上述80.0 g萃取液中含有油红O质量分别为0、40、80、120、160、200、240、280、320、360、400和440 μg。工作液梯度范围需包含所要检测样品萃取液的浓度极值。取200 μL各梯度工作液置于酶标板，在波长510 nm处测定吸光度，以油红O质量分数为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。重复3次。

1.5 统计分析

在本研究中，草鱼个体肠系膜脂肪沉积量是以样品吸附并萃取出的油红O质量来表示，计算公式∶wo= ω ×we，式中，ω为利用标准曲线计算出的样品萃取液油红O质量分数(μg/g)；we为萃取所用无水乙醇的质量(g)，本研究所有样品的萃取液用量统一设置为80.0 g；wo为样品萃取出的油红O质量(μg)。另外，为了进一步判断萃取量化结果的可靠性，随机取少量萃取后内脏团样品，将尚存的肠系膜组织剥离称重，检验其与传统刮取法定量数据的关联程度。

使用SPSS 19.0软件对观测数据进行描述性统计、Pearson相关分析、系统聚类以及多元逐步回归分析。其中，采用Kolmogorov-Smirnov检验判断数据正态性。采用R型聚类对观测变量进行分析，聚类方法选择最远邻元素法结合Pearson相关性。多元回归分析采用双向逐步回归方法，设定自变量引入或剔出方程的概率值分别为0.05和0.10。

2 结果

2.1 样品的染色与萃取效果

草鱼内脏团解剖、固定、脱水、染色等操作对肠系膜脂肪组织的结构完整性影响较小，脂肪细胞内脂质物质得到较好保留。如图版-5所示，内脏团样品经9 min定时浸染，油红O染料可对草鱼肠系膜脂肪组织特异性、均一化染色，染料渗透性强，匀染性好；脂肪组织得以充分着色，而肠道、肝胰脏等脏器组织则着色轻微。从图版-6可见，染色样品经无水乙醇萃取后，吸附在脂肪组织内的油红O染料被完全抽提。以上实验结果表明，利用油红O脂溶性染料的固有特性，可实现草鱼肠系膜脂肪组织的定向充分染色；良好的抽提效果则为后续精确定量提供了必要条件。

图版 草鱼肠系膜脂肪组织的油红O染色与萃取效果1. 草鱼解剖；2. 内脏团初始样品；3. 样品固定；4. 样品脱水；5. 样品油红O染色；6. 萃取后样品；a. 肠系膜脂肪组织；b. 肠；c. 肝胰脏。Plate Oil red O staining and extraction of mesenteric adipose tissue of C. idella1. dissected C. idella; 2. original visceral mass; 3. sample fixation; 4. sample dehydration; 5. oil red O staining; 6. Sample after extraction; a. Mesenteric adipose tissue. b. Intestine; c. Hepatopancreas.

2.2 标准曲线的绘制

通过酶标仪测定12个不同浓度油红O标准液在510 nm波长下吸光度值，绘制标准曲线。结果如图1所示，油红O浓度(质量分数)与吸光度值之间呈现近乎直线的线性关系，求得拟合回归方程∶y= 0.0276x+ 0.0403,R2= 0.9997。当油红O质量分数在0 ～ 5.5 μg/g范围内时，可以依据此方程进行样品定量分析。

图1 油红O的标准曲线Fig. 1 Standard curve of oil red O

2.3 肠系膜脂肪沉积量的测定

依据建立的标准曲线方程，将萃取液吸光度值换算为油红O质量分数(μg/g)；在已知萃取液质量(80.0 g)的前提下，通过简单的乘法运算即可获得溶液中油红O的质量。由整个操作流程可知，萃取的油红O源于样品起始阶段所吸附的油红O，而吸附量与样品肠脂组织总量密切相关，因此，肠系膜脂肪沉积量可由萃取出的油红O质量来表示。

为了进一步检验油红O萃取法，将20尾个体萃取后样品的肠脂组织直接刮取称量，与萃取量化结果进行对比。由图2散点图可知，传统刮取称重与萃取量化数据具有较高的相关性(r=0.80，P＜ 0.01)，这也一定程度表明本研究染色-萃取测定方法的可靠性。

2.4 度量性状的描述性统计

对采集的200尾草鱼性状表型值进行描述性统计分析，结果见表1。在度量的8个数量性状中，体重、内脏质量和肠系膜脂肪沉积量的变异系数(8.93% ～ 24.49%)整体要高于体长等体尺性状(3.17% ～ 4.25%)。尤其是，在体重变异系数为8.93%的草鱼群体中，肠系膜脂沉积量的变异系数达到24.49%，表明该性状具有丰富变异特征及遗传改良潜力。另外，所有性状表型值经过K-S检测，P值均大于0.05显著性水平，表明符合正态分布。

表1 草鱼8个数量性状的描述性统计(n=200)Tab. 1 Descriptive statistics of eight quantitative traits in C. idella (n=200)

2.5 相关与聚类分析

Pearson相关分析结果显示，体重与观测的各体尺性状间呈高度正相关(r= 0.73 ～ 0.92，P＜0.01)，其中与体长相关性最高；内脏质量与各体尺性状呈中等正相关(r= 0.51 ～ 0.70，P＜ 0.01)，其中与体高相关性最高；肠系膜脂肪沉积量则与各体尺性状呈低度正相关(r= 0.33 ～ 0.42，P＜0.01)(表2)。上述各性状间的相关关系反映出草鱼的形态学特征。此外，在肠系膜脂肪沉积量与其他各性状间，肠系膜脂肪沉积量与内脏质量的相关系数最大(r= 0.60，P＜ 0.01)。

表2 草鱼8个数量性状的相关分析(n=200)Tab. 2 Correlation analysis of eight quantitative traits in C. idella (n=200)

R型变量聚类更为直观的展现各观测性状间的关系结构 (图3)。其中，肠系膜脂肪沉积量与内脏质量单独聚为一支，反映了二者紧密联系，说明采用新方法获得的肠系膜脂肪量化数据属于脏器关联指标，同实际情况相符。

图3 草鱼8个数量性状的R型聚类图Fig. 3 Dendrogram of R-cluster analysis of 8 quantitative traits in C. idella

2.6 逐步回归分析

以肠系膜脂肪沉积量为因变量，以体重、体长等6个形态指标为自变量，开展多元逐步回归分析(表3)。结果显示，只有体高、体宽2个显著性自变量得以保留，剩余指标变量因无显著性而被剔除，但建立的二元回归方程决定系数R2仅有0.20，意味着简单易测的形态指标只能解释肠系膜脂肪沉积量变异的20%，表明基于形态指标的回归模型预测肠系膜脂肪沉积量的效果不佳。

表3 草鱼肠系膜脂肪沉积量与各形态指标的逐步回归分析(n = 200)Tab. 3 Stepwise regression analysis between mesenteric fat weight and various morphological indexes in C. idella (n = 200)

3 讨论

3.1 油红O染料的特性与应用研究

油红O是一种脂溶性偶氮染料，可高度溶解于脂类物质，并能够使其特异性着色，因此常被用于细胞内脂滴的定位与指示变化，涉及冰冻组织切片[13]、细胞鉴定[14-15]、大体染色[16-17]等技术内容，用以揭示脂质代谢与机体生理、病理过程的联系。本研究利用油红O有色溶液可量化的另一特性[18]，基于朗伯-比尔定律，通过萃取液吸光度检测，首次将其拓展应用于鱼类肠系膜脂肪沉积量的定量分析。

3.2 染色-萃取定量方法的操作要点

与传统刮取称量方法相比，本研究开发的草鱼肠系膜脂肪定量方法，具有取样完整，操作便捷，量化精准的特点，尤其适用于批量、小规格实验鱼采样需求。简要操作流程∶鱼体麻醉解剖、内脏团采集、个体标记、样品固定、脱水、染色、漂洗、萃取和定量分析。具体实施步骤中，需要说明的∶(1)内脏团中胆囊的摘除，是防止有色胆汁可能对染色过程、萃取液吸光度检测造成干扰。(2)实施芯片标记操作，不仅用于识别区分个体，也为后续共同染色提供必要条件，以达到样品处理时间、处理环境的一致性。(3)实施组织固定操作，主要是防止取样时间较长引发的组织自溶，避免细胞内脂质流失，为大批量采样提供宽松的时间。(4)染色前实施脱水操作，是先期让样品快速大幅脱水，显著缓解后续无水乙醇操作环境中样品自行脱水可能引起的干扰。(5)选择无水乙醇作为染色、萃取过程的溶剂，主要是乙醇与油红O具有良好的相溶性，而且乙醇相比其他醇类易于获得，价格低廉、低毒性、刺鼻气味轻微。(6)实施漂洗步骤，是去除样品表面残留的工作液，防止残液影响定量分析。(7)通过绘制的标准曲线，可将测定的萃取液吸光度值转换为相应的油红O浓度(质量分数)，而拟合的标准工作曲线决定系数R2达到0.9997，充分表明样品检测过程可靠，量化数据精准。(8)该定量方法可拓展应用于不同规格实验草鱼或其他鱼类，而样品染色时间、萃取乙醇用量等参数以及标准曲线的绘制也应根据实际情况作出相应调整。例如，样品染色时间，既要保证鱼体脂肪组织获得充分染色，又要防止染色时间过长导致非脂肪组织被动着色问题；萃取乙醇用量则以能够将染样里的油红O萃取完全为准。

在本研究中，草鱼个体肠系膜脂肪沉积量是以样品吸附并萃取出的油红O质量来表示。由于所有草鱼测试样品是在同一环境条件下处理，染液浓度、染色时间等关键参数一致，所以测定结果能够较为精准的展示出样品间脂质沉积的差异程度。需要说明的是，虽然染色-萃取量化结果与传统刮取称重保持了较好的相关性，但新测定方法属于相对定量范畴，所获数据代表个体肠系膜脂肪沉积的相对含量，仅适用于同批次或相同处理条件下样品的比较分析。

3.3 草鱼肠系膜脂肪沉积量的特征

采集同一养殖环境的200尾草鱼性状表型值，统计分析发现，利用染色-萃取方法测量草鱼肠系膜脂肪沉积量范围为92.66 ～ 318.07 μg，变异系数达到24.49%，对比体重等其他表型性状3.17% ～8.93%的变异系数，显示出较为丰富的变异特征，为遗传改良奠定了良好的物质基础。实际上有文献显示，采用传统刮取定量方法，在体重变异系数10.13%的商品规格草鱼群体中，肠系膜脂肪性状的变异系数也达到21.30%，同样预示草鱼体脂性状具有较大选育潜力[2]。

进一步的相关与聚类分析表明，肠系膜脂肪沉积量与内脏质量相关性最高，并且聚为一类，符合预期的脏器关联因子，但与各体尺性状的相关性较低，而且多元线性回归分析显示，简单易测的表型指标对肠系膜脂肪沉积量的变异解释程度较低，说明通过间接预测途径获取性状表型值的可信度不高，这也意味着该性状的精确测量可能无法避免宰杀活体。另一方面，虽然有研究报道腹腔内脂肪组织可以实现无损定量检测，如核磁共振成像技术对鱼类脂肪组织的可视化研究[19]，但该技术依赖昂贵的大型仪器以及较复杂的软件程序，限制了其应用范围。

综上所述，本研究利用脂溶性染料油红O可特异性着色脂肪的特性，开发出一种精确、便捷定量草鱼肠系膜脂肪组织含量的新方法。基于操作步骤论述及采样数据分析，显示出本定量方法的可靠性及适用范围，也为草鱼体脂性状改良提供了技术参考。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）