水产动物维生素D3需求、吸收和转运及其与糖脂代谢的关系

柳声赞， 罗 智

(华中农业大学水产学院，分子营养实验室，湖北 武汉 430070)

维生素D3是一种非常重要的维生素，在调控肠道和肾脏上皮细胞中钙磷元素的吸收以及骨钙的调用过程发挥了重要作用[1]。此外，维生素D3可调控先天免疫和获得性免疫，其免疫调节作用对于机体抗病能力极为重要[2]。对于鱼类来说，维生素D3的生理功能体现为促进鱼体生长，增强免疫力[3]。如Sivagurunathan等[4]发现，维生素D3可显著增加金头鲷(Sparus aurata)全鱼钙磷比例，而维生素D3缺乏则会导致其骨骼发育异常，矿化程度降低。近年来有学者研究了维生素D3对水产动物生长发育的调控作用，确定了水产动物对维生素D3的最佳需求量，因此，有必要对近期维生素D3的研究进展进行综述，总结维生素D3对水产动物机体代谢的调控作用和机制，以期增进我们对维生素D3营养生理功能的理解。

1 水产动物机体维生素D3来源、需求量及影响因素

1.1 维生素D3来源

维生素D是一种机体必需的脂溶性营养素，为固醇类衍生物，包含维生素D2-D7共7个成员，其中最重要且在动物体内广泛存在的为维生素D3[5]。在动物机体内，维生素D3需要转化为有激素活性的1α,25-二羟基维生素D3(1α,25(OH)2-VD3，1,25D3)继而执行调节细胞代谢的功能[6]。一些陆生动物表皮内存在7-脱氢胆固醇(7-DHC)，可以在太阳光的照射下产生维生素D3并在肝脏和肾脏中进一步代谢为1,25D3[7]。除此之外，陆生脊椎动物可以通过食物获取维生素D3，食物中获取的维生素D3或25-羟基维生素D3(25OH-VD3，25D3)经过肝脏和肾脏的代谢产生1,25D3[8]

相对于陆生动物，水产动物受到阳光照射量和自身限制的影响而几乎不能合成维生素D3。Garefino等[9]的研究表明，海水绿蠵龟(Chelonia mydas)暴露于太阳光照后血浆中维生素D3的含量升高，表明绿蠵龟可通过紫外线的照射产生维生素D3。然而，越来越多的研究认为，鱼类因不能接收到充分的太阳辐射而几乎不能自身合成维生素D3。Sunitarao等[10]使用和太阳光紫外线等效的300 nm紫外光照射莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)，发现鱼体内的7-DHC含量有所降低，同时维生素D3的含量显著上升，不过15 h照射的转换效率仅为0.13%，表明鱼类虽然可以像陆生脊椎动物一样通过光化作用合成维生素D3,但却不是自然条件下体内积累维生素D3的主要方式。Sugisaki等[11]的研究表明金鱼体内7-DHC不能合成1,25D3。然而鱼类肝脏和肌肉等组织中储存着大量的维生素D3[12]。对于甲壳类和贝类，由于是底栖类动物且具有外壳，通常认为其难以合成维生素D3。因此，水产动物需通过食物获取维生素D3。人工养殖条件下，饲料中维生素D3是水产动物机体所需维生素D3的主要来源。

1.2 维生素D3的需求量

缺乏维生素D3对水产动物产生不利影响，包括生长性能下降等[13]，饲料中适宜的维生素D3可促进水产动物的生长。Lock等[12]总结了2010年以前部分养殖鱼类对维生素D3的需求量，为了避免重复，本文仅系统概括最近12年内(2011—2022年)有关贝类、虾蟹类以及鱼类共23种水产动物(包含10种淡水鱼类、8种海水鱼类、1种棘皮类、2种甲壳类、2种软体动物)对维生素D3的最佳需求量 (表1)。

1.3 维生素D3需求的影响因素

饲料脂质含量对于鲈鱼的研究发现，使用鱼粉作为蛋白源的饲料来饲养大口黑鲈，其达到最大增重率所需维生素D3的含量[40]较使用酪蛋白作为蛋白源的饲料来饲喂欧洲鲈达到最大增重率所需维生素D3的含量高[24]。由于维生素D3在肠道中以类脂质转运的方式被吸收[41]，因此，过多的脂质可能通过与维生素D3形成竞争关系，从而降低维生素D3的吸收，饲料中维生素D3的添加量需要相应地增加，才能满足最佳维生素D3摄取。

水产动物的生长发育阶段不同生长阶段的水产动物对维生素D3的需求不同。Liu等[36-37]研究表明，达到最大生长时幼蟹对维生素D3需求量较稚蟹要高，而达到最大蜕壳频率时幼蟹的需求量则约为稚蟹的2倍，由此可见，蟹类生长发育的早期对维生素D3需求量要高于发育后期，在鱼类中也得出了类似的结论[28-29]。水产动物生长初期，代谢较强，对维生素D3的需求量也相对较高。

水产动物生存环境对比淡水和海水水产动物对维生素D3的需求量，发现海水动物需求量通常更低。原因之一可能是海水中钙等微量矿物元素比淡水丰富，从而使海水动物对维生素D3介导的钙磷平衡调节的依赖性比淡水动物低，因而海水动物对维生素D3的需求量相对淡水动物较低[34]，另一方面，浅海养殖的动物相比淡水动物能更多的暴露于太阳光辐射，可以合成一部分机体所需维生素D3。

评价指标通常情况下，增重率(WG)是评价维生素D3需求量的常见指标。除此之外，不同的检测指标下水产动物对维生素D3的需求量会不同。如Liu等[36-37]以蜕壳频率、增重率和特定生长率来评价中华绒螯蟹对维生素D3的需求量，发现饲料中维生素D3添加水平要达到10000 IU/kg，中华绒螯蟹才能达到最大的蜕壳频率，而添加水平为5685.43和6496 IU/kg，增重率和特定生长率分别达到最大水平。日本花鲈达到最大WG所需饲料维生素D3含量为431 IU/kg，而肝脏达到最大维生素D3积累所需水平则为2444.4 IU/kg[25]。

评价需要量所用的数学模型部分研究以获得最大增重组对应的维生素D3含量为需求量，也有研究则会在获得相关数据的基础上，运用数学模型回归拟合分析得出维生素D3需求量。常用数学模型有折线回归模型和二阶回归模型。而不同拟合模型也会影响评价维生素D3的需求量，如Shao等[26]发现，二阶回归模型下所得的大菱鲆对维生素D3的最佳需求量是折线回归模型下的两倍多。

水中浮游动植物丰富度自然状态下，浮游动植物可以通过光化学反应合成维生素D3，水产动物通过浮游生物食物链获取并积累维生素D3[42-43]，因此，人工养殖条件下水质中浮游动植物的丰富度可对水产动物对维生素D3的需求量有影响，水质中浮游动植物含量越高，水产动物对饲料维生素D3的需求量越低。

其他影响因素关于影响鱼类肠道对维生素D3吸收的因素研究较少，部分在动物模型或模式细胞上获得的研究结果可供一定程度的参考。如长链脂肪酸可抑制肠道细胞对维生素D3的吸收能力，使用混合脂肪酸则可以缓解这种抑制作用[44]。饲料中添加高比值的(单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸含量比)脂肪酸可增加血浆中维生素D3含量[45]。由于维生素D属于甾醇类化合物，因此食物中的β-谷甾醇、植物固醇等来自植物的甾醇类化合物可和维生素D3的吸收形成竞争关系，降低肠道维生素D3的吸收[46]。

2 水产动物维生素D3吸收、转运和代谢机制

研究表明，鱼类在其生命周期中一直在积累维生素D3，且积累量随着饲料维生素D3含量增加而增加[12,29,31]，在肝脏、脂肪和肌肉会积累大量的维生素D3[12]。水产动物维生素D3通过消化肠道吸收，经过血液循环运输到肝脏，再经过肝脏代谢产生具有激素活性的1,25D3。

2.1 维生素D3的吸收

水产养殖动物主要从饲料中获取维生素D3，肠道是吸收的主要器官。肠道维生素D3吸收机制和脂类类似[44]，因为肠道中维生素D3在吸收前和磷脂、胆固醇和甘油酯等形成胶团，维生素D3在胶团中占比越多，则吸收越多，胶团化的维生素D3以类胆固醇的形式参与转运[41]。脂蛋白是盲鳗(Myxini)、灰斑竹鲨(Chiloscyllium griseum)和蓝子鱼(Siganus)等海水鱼类25D3跨膜运输的主要机制[47]。水产养殖动物肠道维生素D3的吸收机制尚处于推测状态，有关哺乳动物肠道维生素D3的吸收机制未完全阐明。如Reboul等[48]研究表明，抑制肠道细胞系Caco-2中SR-BI和NPC1L1后，维生素D3的吸收显著降低，肾脏细胞系HEK过表达SR-BI、NPC1L1和CD36则会显著增加维生素D3的吸收，在小鼠(Mus musculus)肠道中过表达SR-BI也会显著增加维生素D3的吸收，表明胆固醇转运载体SR-BI、CD36和NPC1L1参与肠道维生素D3的吸收。此外，维生素D3还可通过被动扩散的方式参与转运，但不是主要方式[48]。在肾小管维生素D3稳态调控上，存在megalin和cubilin受体蛋白介导的维生素D3-DBP复合体胞吞吸收方式[49-50]。肠道也是鱼类和虾蟹类营养物质吸收的主要部位，因此，水产动物尤其是鱼类或许也通过上述方式吸收维生素D3，但仍需要进一步研究以探讨水产动物肠内详细吸收机制。

2.2 维生素D3的转运

各种形式维生素D3在血液中与维生素D3结合蛋白(vitamin D binding protein, DBP)结合进行运输，经血液循环到达肝脏、肾脏或其他器官进行代谢或发挥调控作用[51]。在鱼类中，目前已确定了斑马鱼(Danio rerio)的DBP，该蛋白在不同动物类群之间相对保守[52]。吸收的维生素D3和其代谢物通过结合到DBP后在血液中转运[53]，DBP和其他白蛋白一起结合了血液循环中99%的维生素D3[53]。目前尚未有虾蟹类或软体类DBP的研究报道。

2.3 1,25D3在水产机体内合成和代谢机制

食物中摄入的维生素D3必须经过两步氧化步骤转化为有活性的1,25D3才能作为激素参与到细胞生命过程。对于哺乳动物而言，维生素D3的两步氧化过程分别发生在肝脏和肾脏中。鱼类则不同，Takeuchi等[54]的研究表明，草鱼和牙鲆(Paralichthys olivaceus)的肝脏中存在1,25D3合成第二步所需的酶即CYP27B1，且活性比肾脏中的强，25D3在肝脏中生成后会继续在肝脏中立即合成1,25D3，表明鱼类肝脏可以替代肾脏完成活性维生素D3合成的第二步。Bevelander等[55]克隆出金头鲷cyp27a1基因，与哺乳动物不同的是该基因在金头鲷肝脏中的表达量非常低。Peng等[56]发现，敲除斑马鱼的cyp2r1基因后显著降低了体内25D3的合成量，第二步cyp27b1和cyp24a1等维生素D3代谢相关基因已经得到确认。此外，斑纹隐小鳉(Kryptolebias marmoratus)和斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)体内和人类(Homo sapiens)的直系同源基因cyp2r1已得到确定[57-58]。图1指出了鱼体内维生素D3的代谢过程。

图1 维生素D3在水产动物体内的代谢过程Fig. 1 Vitamin D3 metabolism process in aquatic animals

代谢产生的1,25D3进入血液循环到达其他细胞，作为细胞外信号调节细胞活动，也可作用到肝细胞本身从而调节肝细胞代谢。1,25D3调节细胞活动有两种机制，第一种是作为第一信使通过与维生素D3的膜受体(membrane vitamin D receptor,mVDR)结合诱导下游激酶级联信号通路的产生而对外界信号产生快速响应。另一种则是作为配体与细胞质中维生素D3的核受体(nuclear VDR,nVDR)结合后移位至细胞核并与核RXR(retinoid X receptor)形成转录因子复合物，该转录因子复合物可识别并结合目标基因启动子序列上的维生素D3响应元件(VDRE)，从而调控目标基因的表达[59]。

维生素D3膜受体有两种类型，第一种是新型维生素D3膜受体 (membrane associated, rapid response steroid-binding, 1,25D3-MARRS)，维生素D3结合到MARRS后可诱导下游产生激酶信号级联反应，维生素D3与另一种膜受体结合则会伴随细胞膜穴样内陷的产生，从而产生下游的非基因组信号通路[60-61]。Larsson等[62]报道大西洋鳕(Gadus morhua)和鲤的肠上皮细胞基底侧膜可能具有24,25D3的受体，此受体可在数秒内导致肠细胞内Ca2+的释放，表明该受体介导了由24,25D3诱导产生的快速非基因组途径响应。Larsson等[63]还发现虹鳟(Oncorhynchus mykiss)肠上皮细胞基地侧膜具有1,25D3受体，并可响应1,25D3而增加细胞内Ca2+含量。Nemere等[64]发现，鲤肠上皮细胞基底侧膜上也具有1,25D3受体，且该受体可响应1,25D3而在5 min内显著增加肠上皮细胞中PKC (protein kinase C)的酶活性。目前尚未分离鉴定得到水产动物1,25D3-MARRS和其他膜受体的基因序列，但可推测1,25D3是鱼类机体代谢和生长的重要信号分子。

另一种维生素D3受体为核维生素D3受体[58]。众多研究报道了水产动物体内nVDR的基因全序列以及对维生素D3的表达响应。Suzuki等[65]首次克隆出牙鲆体内vdrα和vdrβ两种亚型，二者在氨基酸序列上具有86%的同源性，其中vdrα同人、小鼠和大鼠(Rattus norvegicus)的vdr具有70%以上的同源性。Maglich等[66]报道红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)体内亦有vdrα和vdrβ两种亚型，其中vdrα在各组织中广泛表达而vdrβ仅在肠道中表达。Whitfield等[67]克隆出七鳃鳗(Petromyzontidae)vdr基因，该vdr基因在COS-7细胞中表达后对1,25D3具有很大的结合活性，且结合后能反式激活包含有大鼠和人类vdre序列的报告基因，此研究首次报道鱼类VDR能调控哺乳动物基因表达，说明VDR在脊椎动物中的作用具有保守性。Sugiura等[68]报道虹鳟肠道和肾脏vdr基因的表达受到低磷饲料的调节，与维生素D3协同调节机体磷稳态平衡。Lock等[69]报道三文鱼体内具有全长以及两个亚型变体的vdr表达。Howarth等[70]克隆出青鳉(Oryzias latipes)体内vdr的两种旁系同源物vdrα和vdrβ，其中VDRβ与1,25D3的结合活性高于VDRα，为人类体内VDR的等效直系同系物。Craig等[71]报道斑马鱼肝脏和肠等器官中都有VDR蛋白表达，其中1,25D3可诱导肠道VDR蛋白表达。刘群等[72]从虹鳟肾脏中克隆出了vdrα的全长cDNA序列。Kollitz等[73]研究表明鳐(Rajiformes)和多鳍鱼的VDR具有1,25D3结合活性，并能和人类的RXR形成反式激活复合体激活报告基因的表达。Cheng等[22]报道了黄颡鱼体内vdr基因表达量会随饲料维生素D3含量增加而先增加后降低。Liu等[37]报道了中华绒螯蟹肝胰腺中vdr基因的表达量随着饲料维生素D3的添加呈现先增加后降低的趋势。Huang等[74]克隆出皱纹盘鲍体内vdr基因序列，且vdr在肝胰腺和外套膜中的表达量显著高于其他组织，vdr基因干扰实验表明，维生素D3可通过VDR抑制细胞凋亡和诱导细胞自噬。Goksøyr等[75]报道大西洋鳕体内也具有vdrα和vdrβ两种亚型。上述这些研究均表明水产动物内广泛存在vdr基因的表达，其中鱼类通常具有vdrα和vdrβ两个亚型，这些nvdr基因可响应维生素D3而调节机体生命活动，为VDR调节水产动物机体代谢研究奠定了基础。图2总结了水产动物机体内维生素D3发挥作用的机制。上述众多研究已经证实水产动物体内vdr基因响应维生素D3的表达，为后续研究奠定基础。维生素D3转化成1,25D3，通过VDR调控水产动物体内糖脂代谢，因而对机体生长代谢具有重要作用。

图2 1,25D3作为第一信使和VDR配体调控鱼类生命活动的机制Fig. 2 Mechanisms of calcitriol as the first messenger cooperating with VDR ligand to regulate life activity

3 维生素D3调控水产动物体内糖和脂类代谢

以往有关维生素D3的研究主要集中在对机体钙磷平衡和骨骼代谢以及机体免疫的影响[25,76]。然而最近有关维生素D3调控机体营养物质代谢也引起重视。从营养学的角度，糖类的分解代谢可为细胞活动提供能量，而脂类是机体内的储能物质，因此很有必要弄清楚维生素D3和糖、脂代谢的关系。

3.1 维生素D3调控糖类代谢及机制

糖类是三大营养物质之一，负责代谢产生机体生命活动所需的能量或以糖原的形式储存能量。Miao等[14]研究表明，团头鲂血清中胰岛素含量随着饲料中维生素D3添加水平增加而先上升后下降，添加量达到2000 IU/kg达到最高，血清葡萄糖呈现先降低后上升的现象，表明添加适量维生素D3可通过升高胰岛素含量而增强团头鲂机体葡萄糖分解代谢过程。Li等[38]研究表明，饲料中添加1000 IU/kg维生素D3可显著缓解由高糖饲料导致的皱纹盘鲍血清葡萄糖含量的上升，进一步研究发现，维生素D3可增强肝胰腺中己糖激酶(HK)基因表达量和酶活性，提高肝胰腺胰岛素受体基因ir和葡萄糖转运载体基因glut1的表达量，提高肌肉中ir表达量和糖原磷酸化酶PYG及糖原合成酶GS的活性，表明维生素D3可通过增强葡萄糖分解以及糖原合成来降低血浆葡萄糖含量。

目前尚未有以水产动物为研究对象探究维生素D3对糖类代谢影响的报道。在小鼠实验中，Mutt等[77]发现，饲料维生素D3缺乏会诱导胰岛素抵抗，导致血浆葡萄糖含量升高，补充维生素D3则可通过激活PI3K-Akt-FOXO1途径显著抑制糖异生，并同时增加肝糖原含量从而防止胰岛素抵抗。

3.2 维生素D3调控脂代谢及机制

脂类是机体内三大营养物质之一, 同时也是机体内最重要的储能物质。国内外研究均表明维生素D3可以调节水产动物体内的脂质代谢过程。Miao等[14]的研究发现，随着饲料维生素D3添加水平提升，团头鲂血清TG整体呈现先下降后上升的趋势，添加水平为1000 IU/kg时达到最低，8000 IU/kg时达到最高，说明饲料适量维生素D3添加具有降低机体脂质沉积的作用，但是添加过多则适得其反。对于吉富罗非鱼, 喻丽娟等[18]发现，随着饲料维生素D3的添加, 全鱼和肝脏中脂质含量呈现先上升后下降的趋势, 当添加量超过200 IU/kg后可显著降低脂质沉积。对于点带石斑鱼(Epinephelus coioides), He等[28]研究发现，随着饲料中维生素D3的添加, 肝脏中脂质含量显著下降,当维生素D3添加达到4000 IU/kg时具有最佳的降脂效果，表明饲料维生素D3的添加使得肝脏激素敏感性脂肪酶HSL、脂肪酶HL和脂蛋白脂肪酶LPL的活性呈现显著上升后又显著下降的趋势，hl基因表达量呈现同样的趋势，表明一定剂量的维生素D3添加可通过增加脂肪酶的活性降低脂质沉积，而过多的维生素D3则正好相反。Lin等[29]的研究同样发现点带石斑鱼血清中TG含量随饲料维生素D3水平的增加呈现下降的趋势，高密度脂蛋白胆固醇HDL-C呈现先上升后下降的趋势，添加量达1000 IU/kg含量最大，表明维生素D3的添加显著降低肝脏脂肪酸合成酶FAS活性和基因表达量，肝脂肪酶HL活性和基因的表达量呈现先上升后下降的趋势，与He等[28]的研究结论相同。综上所术，维生素D3可降低鱼体脂质沉积，但是维生素D3在海水鱼类和淡水鱼类调控脂质代谢具有一定差异。在虾蟹类，Dai等[35]研究发现，以19 200 IU/kg为界限，凡纳滨对虾肝胰腺内脂肪生成相关基因srebp、acc1和fas的表达量随维生素D3添加水平呈现先上升后下降的趋势，而脂质分解相关基因cpt1、aco、fabp和fatp的表达量随维生素D3添加水平呈现上升的趋势，表明维生素D3在一定范围内通过增加肝胰腺脂肪含量，从而具有促生长效应，同时维生素D3可降低肝脏脂质沉积。对于贝类，Yang等[78]的研究显示，维生素D3的添加水平为10 000 IU/kg时，马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)肝胰腺内鞘脂的代谢与添加水平为1000 IU/kg时有显著差异。

目前有关维生素D3调控水产动物脂类代谢的机制研究较少。斑马鱼是一种模式水产动物，常被用于研究脂质代谢的分子机制。如Peng等[56]发现，将斑马鱼体内25D3合成基因cyp2r1敲除后，内脏脂肪组织脂肪细胞增多，脂肪蓄积，体外实验表明，配体1,25D3的缺乏导致斑马鱼VDR无法结合pgc1α的启动子区域而降低了其基因和蛋白表达水平，使得下游线粒体生物生成相关通路NRF-1和ERRα通路受到抑制，脂肪合成和摄取相关PPARγ通路得到促进，补充25D3后相应通路又得到缓解，表明正常情况下，1,25D3可通过线粒体途径促进脂肪组织脂质代谢，避免脂质沉积。Dai等[79]的研究发现，维生素D3可显著缓解由高脂饲料导致的凡纳滨对虾肝胰腺中肝脏脂质合成基因通路相关基因srebp、acc1和fas的表达量增加，以及脂质分解相关通路基因cpt1、fabp和fatp的表达量降低，进而缓解高脂饲料导致的肝胰腺脂质沉积，表明维生素D3可促进凡纳滨对虾肝胰腺中经典自噬通路AMPKKα-PINK1-Parkin的激活而诱导线粒体自噬，以降低肝胰腺脂质沉积。

综上，维生素D3可通过诱导相关酶活性的变化而调控脂质代谢，其中维生素D3可通过诱导自噬而减弱糖或脂代谢对细胞的不利影响。

4 总结与展望

当前有关水产动物维生素D3营养生理的研究主要集中在对它的需要量的探讨，而有关水产动物对饲料维生素D3的吸收、转运和代谢的研究极其缺乏。同时，有关维生素D3对糖、脂代谢的影响研究还非常零碎，不系统。今后需加强有关水产动物维生素D3的代谢、调控机制，以及维生素D3调控糖、脂代谢机理的研究，为水产饲料业和水产养殖业发展提供更多参考。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）