艾司氯胺酮通过NMDA受体促进小鼠成骨细胞增殖分化

郑马强,马智聪

(1山西医科大学麻醉学院,太原 030001;2山西医科大学第二医院麻醉科;*通讯作者,E-mail：mazhicong1970@126.com)

艾司氯胺酮(esketamine, Ket)是临床上常用的一种静脉麻醉药,主要通过非竞争性拮抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate-receptor,NMDAR)阻断兴奋性神经传导来发挥全身麻醉作用。艾司氯胺酮作为氯胺酮的对映异构体,它与NMDAR具有更强的结合力,从而能发挥更强的镇静、镇痛作用,且对呼吸和循环的抑制小,苏醒更快,此外它还具有神经保护作用[1]。有研究指出,NMDAR在骨重塑方面也发挥了一定的作用,并参与了骨代谢的过程[2],然而其确切作用尚不明确。成骨细胞作为骨形成过程中的主要功能细胞,可通过特异性分泌多种生物活性物质调控骨基质的合成、重塑和愈合过程[3]。前期研究发现艾司氯胺酮可促进小鼠成骨细胞的增殖及分化[4],而艾司氯胺酮主要通过作用于NMDAR而发挥其效应,因此本实验通过观察艾司氯胺酮和NMDAR激动剂对小鼠成骨细胞增殖及分化的影响,探讨艾司氯胺酮作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 4周龄C57BL/6雄性小鼠,购自山西医科大学实验动物中心。本研究经山西医科大学第二医院医学伦理研究委员会审查并批准(DW2023002)。

1.1.2 主要试剂 NMDA(货号：B1624,美国Apexbio公司);盐酸艾司氯胺酮溶液(规格：50 mg/2 mL,批号：221109BL,江苏恒瑞公司);α-MEM培养基(货号：SH30265.01,美国Hyclone公司);胎牛血清(货号：11011-8611,美国Gibco公司);青链霉素混合液(货号：P1400,中国北京索莱宝公司);胰蛋白酶-EDTA(0.25%含酚红)(货号：T1300,美国Gibco公司);地塞米松(货号：D4902,中国上海Sigma Aldrich公司);L-抗坏血酸(货号：A4403,中国上海Sigma Aldrich公司);β-甘油磷酸(货号：G806967,中国上海麦克林公司);BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(货号：c3206,中国上海碧云天公司);ELISA试剂盒(货号：JL13034,中国上海江莱公司);总蛋白提取试剂盒(货号：EX1100,中国北京索莱宝公司);TRIzol RNA提取液(货号：RR036A,中国武汉Servicebio公司)等。

1.1.3 主要仪器 超净工作台购自中国江苏苏州安泰空气技术有限公司;CO2培养箱购自德国Heracell公司;离心机购自美国Thermo Fisher公司;LX800酶标仪购自美国Thermo Fisher公司;荧光定量PCR仪购自美国Biord公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原代成骨细胞的诱导和培养 参考田虹等[5]的方法进行成骨细胞的体外培养,取4周龄C57BL/6雄性小鼠,颈部脱臼法处死后,置于5%乙醇中浸泡5 min消毒处理。于超净工作台中剥离肌肉和组织,取双侧股骨及胫骨,用PBS重复洗涤2次,剪去骨骺端,然后用无菌注射器吸取含10%胎牛血清的α-MEM培养基,把股骨及胫骨中的骨髓液缓慢冲洗到细胞培养皿中,反复冲洗直至骨髓腔发白为止。吹打混匀细胞后置于37 ℃,5%CO2培养箱中,隔日换液,弃去细胞培养皿中漂浮的细胞,贴壁的细胞即为骨髓间充质干细胞。当细胞密度长至80%融合时,按照1∶2的比例进行传代培养。接种后更换为含10%胎牛血清,10 nmol/L地塞米松,50 μg/mL抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油酸钠的成骨细胞培养基[6]进行诱导。诱导培养21 d左右后,将其接种于置有盖玻片的6孔培养板中,根据碱性磷酸酯酶试剂盒说明书,对细胞进行碱性磷酸酶染色。在显微镜下随机选取5个视野观察染色结果,阳性细胞可见蓝紫色颗粒沉积在胞质碱性磷酸酶活性部位,证明同批细胞为所需成骨细胞,可用于后续实验。

1.2.2 CCK-8细胞毒性实验检测细胞活性 将成骨细胞以每孔5 000～10 000个的细胞密度接种于96孔板中,每孔加入100 μL含10%胎牛血清的成骨细胞培养基。于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养24 h,待细胞贴壁后在各孔中加入含不同浓度NMDA(0,6.25,12.5,25,50,100,200 μmol/L)的成骨细胞培养基。每组设3个复孔,待干预24,48,72,96 h后,于每孔加入10 μL CCK-8试剂,继续在培养箱中避光孵育2 h后,使用酶标仪检测各组波长在450 nm处的吸光度值(OD值)并记录结果,计算平均OD值并绘图。

1.2.3 细胞分组与干预 成骨细胞传代贴壁24 h后,将其随机分为3组：对照组、Ket组和Ket+NMDA组。对照组、Ket组和Ket+NMDA组分别用含10%胎牛血清、100 μmol/L Ket、100 μmol/L Ket和100 μmol/L NMDA的成骨细胞培养基培养。随后置于37 ℃,5%CO2培养箱中继续培养24,48,72 h。

1.2.4 荧光定量PCR(qPCR)法检测Runx2和Osterix的相对表达水平 弃掉旧培养基,用TRIzol法分别提取成骨细胞中的总RNA,采用qPCR法分别检测同一时间点Runx2和Osterix的mRNA的相对表达水平。本实验PCR反应条件为：95 ℃预变性10 min;95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,进行40个循环。以GAPDH为内参进行校正,采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达水平,引物序列见表1。

表1 目的基因特异性引物序列

1.2.5 酶联免疫吸附(ELISA)法检测Bcl-2、Bax以及BDNF蛋白的表达量 采用总蛋白提取液分别提取成骨细胞中的蛋白质,按照酶联免疫吸附试剂盒操作步骤检测成骨细胞中Bcl-2、Bax以及BDNF蛋白的表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 成骨细胞鉴定结果

碱性磷酸酶染色结果可见大量细胞染色阳性,胞质中出现蓝紫色颗粒沉积,确认所培养细胞为成骨细胞(见图1)。

注：箭头所示为成骨细胞。图1 成骨细胞鉴定结果 (×100)Figure 1 Identification of osteoblast (×100)

2.2 CCK-8细胞毒性实验

在同一时间点,0～200 μmol/L的NMDA对成骨细胞活性的影响差异无统计学意义(P>0.05);在一定浓度下,NMDA干预不同时间对成骨细胞活性的影响差异无统计学意义(P>0.05,见图2)。

图2 NMDA对成骨细胞活性的影响Figure 2 Effect of NMDA on osteoblast activity

2.3 Ket对成骨细胞中Runx2及Osterix表达的影响

在同一时间点,与对照组相比,Ket组和Ket+NMDA组Runx2的表达升高(P<0.01);与Ket组相比,Ket+NMDA组Runx2的表达下降(P<0.01,见图3)。在同一时间点,与对照组相比,Ket组和Ket+NMDA组Osterix的表达升高(P<0.01);同时,与Ket组相比,Ket+NMDA组Osterix的表达下降(P<0.01,见图4)。

注：与对照组相比,**P<0.01;与Ket组相比,##P<0.01。图3 Ket对成骨细胞中Runx2表达水平的影响Figure 3 Effect of Ket on Runx2 expression levels in osteoblasts

2.4 Ket对成骨细胞中对Bcl-2、Bax以及BDNF蛋白表达的影响

干预24 h和48 h,与对照组相比,Ket组Bcl-2蛋白的表达量升高(P<0.05);与Ket组相比,Ket+NMDA组Bcl-2蛋白的表达量下降,差异有统计学意义(P<0.05);同时,干预72 h,对照组、Ket组以及Ket+NMDA组Bcl-2蛋白的表达量差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。

表2 Ket对成骨细胞中Bcl-2蛋白表达量的影响 (ng/mL,

干预24 h和48 h,与对照组相比,Ket组Bax蛋白的表达量下降(P<0.05);与Ket组相比,Ket+NMDA组Bax蛋白的表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05);同时,干预72 h,对照组、Ket组以及Ket+NMDA组Bax蛋白的表达量差异无统计学意义(P>0.05,见表3)。

表3 Ket对成骨细胞中Bax蛋白表达量的影响

在同一时间点,与对照组相比,Ket组BDNF蛋白的表达量升高(P<0.05);与Ket组相比,Ket+NMDA组BDNF蛋白的表达量下降,差异有统计学意义(P<0.05,见表4)。

表4 Ket对成骨细胞中BDNF蛋白表达量的影响 (ng/mL,

3 讨论

N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)不仅表达于中枢神经系统中,还存在于调节矿物质代谢的3个主要器官(骨骼、甲状旁腺和肾脏)中,这表明NMDAR在调节钙和磷水平方面也发挥着重要作用。据研究报道NMDAR参与了一系列的生理和病理过程,其中包括骨沉积以及伤口愈合[7,8]。众所周知,成骨细胞在骨修复过程中起关键作用,通过细胞内信号传导,可大量增殖、分化,迁移到骨修复部位,然后经细胞内信号级联反应分泌骨基质,引起基质矿化,从而达到骨修复的目的。最近有研究表明在大鼠颅骨成骨细胞中发现有NMDAR亚基的mRNA表达,并参与到了体外骨吸收的过程中[9]。然而,NMDAR在骨代谢系统中的确切作用尚不明确,为了研究艾司氯胺酮促进成骨细胞增殖及分化的机制,本实验采用艾司氯胺酮和NMDA对体外成骨细胞进行干预,NMDA是NMDAR的一种特异性激动剂,它只与NMDAR相结合,而不会影响其他谷氨酸受体[10]。本实验通过体外实验发现艾司氯胺酮可通过拮抗NMDAR促进成骨细胞的增殖及分化并阐述了其促进作用可能的机制。

Runx2作为调节成骨细胞增殖分化的最上游转录因子,可协同其下游的Osterix促进碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白和骨连接素等蛋白的表达[11,12],刺激成骨细胞分化成熟,最终加速骨折愈合的过程。在成骨细胞发育的过程中,Runx2主要在骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中起作用,Osterix则是成骨细胞的分化和成熟过程中所必需的[13],在Runx2基因或Osterix基因敲除的小鼠中,其血清中骨形成和骨吸收指标均低于对照组,小鼠体内完全缺失成骨细胞[14,15],因此通过测定Runx2及Osterix的相对表达水平可以明确实验干预对成骨细胞增殖及分化的影响。本研究结果显示,与对照组相比,Ket组Runx2和Osterix的表达在24,48,72 h均有升高,同时,与Ket组相比,Ket+NMDA组Runx2和Osterix的表达下降,提示艾司氯胺酮可通过拮抗NMDAR促进成骨细胞的增殖分化。

Bcl-2家族是细胞凋亡过程中的关键分子,其蛋白可分为抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1等)和促凋亡蛋白(Bax、Bak等)[16],通过维持这些蛋白之间的平衡,可以确保细胞的正常增殖分化。增加Bcl-2的表达可以介导细胞的抗凋亡作用,相反,Bax的表达上调则可通过调控线粒体膜的通透性并启动caspase级联反应使细胞发生程序性死亡[17,18]。众所周知,成骨细胞的增殖分化受到多种因素的影响,延缓成骨细胞的凋亡对于骨折愈合有着重要的作用。通过检测不同条件下干预24,48,72 h后成骨细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达量,我们发现在24 h和48 h,与Ket组相比,Ket+NMDA组细胞中Bcl-2蛋白的表达量降低,而Bax蛋白的表达量升高,提示艾司氯胺酮可通过拮抗NMDAR促进抗凋亡基因的表达同时抑制凋亡基因的表达,最终促进成骨细胞的增殖分化;而在72 h,对照组、Ket组以及Ket+NMDA组Bcl-2和Bax蛋白的表达量没有明显差异,这可能意味着艾司氯胺酮只在成骨细胞分化早期发挥对Bcl-2及Bax蛋白表达的调节作用,随着时间的推移,相关蛋白表达已经达到稳定状态,因此它们的表达量将不再发生变化。

BDNF属于神经营养因子家族,主要在中枢和外周神经元组织中发挥作用。然而,BDNF也可由许多非神经元细胞,例如成纤维细胞、成骨细胞,合成和释放。BDNF及其受体存在于骨形成过程的各个阶段,并且都参与了成骨细胞分化的过程[19]。之前的研究发现,艾司氯胺酮可通过拮抗NMDAR增加BDNF的表达进而促进大鼠骨折愈合[20],本实验通过在细胞层面检测不同干预条件下BDNF的表达情况,结果显示,与Ket组相比,Ket+NMDA组细胞中BDNF蛋白的表达量在各时间点均降低,与前述结果一致。最近有研究表明,BDNF可促进Bcl-2基因的表达从而发挥抗凋亡的作用[21,22]。结合王震等[23]的研究结果,BDNF能抑制体外成骨细胞的凋亡,促进成骨细胞的增殖,由此推测艾司氯胺酮可能通过上调BDNF的表达对体外成骨细胞的凋亡起到抑制作用。本实验亦存在一定的不足之处：首先,本实验仅通过酶联免疫吸附法对相关蛋白进行检测,可进一步采用Western blot法评估相关蛋白的具体表达情况;其次,本实验仅选取了对成骨细胞活性无影响的药物浓度进行干预,未能筛选出促进作用显著的药物浓度。因此,在后续实验中可考虑扩大样本量的检测进一步完善实验,为艾司氯胺酮的临床应用提供更加充分的参考。

综上所述,本实验通过对体外成骨细胞进行干预,发现艾司氯胺酮可通过拮抗NMDAR促进成骨细胞的增殖分化,其机制可能与艾司氯胺酮拮抗NMDAR引起BDNF表达增加,进而促进抗凋亡蛋白的表达同时抑制凋亡蛋白的表达,最终对成骨细胞的增殖及分化起到促进作用。