枸杞多糖促进HL-60细胞的吞噬功能

庞洪源,李 帆,华梦晴,宋传旺*

(1蚌埠医学院检验医学院免疫教研室,蚌埠 233030;2慢性疾病免疫学基础与临床安徽省重点实验室;*通讯作者,E-mail：bbmcscw@foxmail.com)

中性粒细胞是机体天然免疫重要的组成部分,在控制疾病发展方面发挥着重要作用[1-3]。中性粒细胞可通过活性氧和水解酶杀伤入侵体内的病原体,因此其处于机体抵抗细菌和真菌的第一道防线[4]。吞噬作用通常指吞噬细胞摄取直径大于0.5 μm颗粒的生物学活动,主要由中性粒细胞、巨噬细胞等专职吞噬细胞完成[5]。枸杞(Lycium bararum)是一种药食两用药材,被广泛应用于保健食品的加工。研究表明其含有多糖类、黄酮类、花色苷类、原花青素类、生物碱类等多种化学成分,且具有免疫调节、抗衰老、降糖调脂、降压、抗肿瘤等药理作用[6-8]。

枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides,LBP)是枸杞的主要活性成分,LBP在预防和治疗多种疾病方面具有巨大潜力,包括促进肠道益生菌生长、保护神经、促进造血、抗衰老、降血脂、抗肿瘤和免疫调节等功能[9-13]。但目前关于LBP是否对吞噬功能产生影响还不甚清楚。本研究以人中性粒细胞株HL-60细胞为研究对象,观察LBP对HL-60细胞吞噬功能的影响,并对相关机制进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 细胞

人中性粒细胞株HL-60细胞系购自武汉普诺赛公司。

1.2 主要试剂

枸杞多糖购于Solarbio公司;GAPDH抗体购于proteintech公司;t-AKT抗体购于proteintech公司;p-AKT抗体购于Beyotime公司;HRP Goat Anti-Rabbit IgG购于Beyotime公司;HRP Goat Anti-Mouse IgG购于Beyotime公司;Wortmannin购于Beyotime公司;PE-Rat IgG2a kappa Isotype Control购于美国Invitrogen公司;PE-Rat IgG2b kappa Isotype Control购于美国Invitrogen公司;PE-Rat IgG1 kappa Isotype Control购于美国Invitrogen公司;PE-CD36抗体购于美国Invitrogen公司;PE-MACRO抗体购于美国Invitrogen公司。

1.3 细胞株的培养和分组

人中性粒细胞株HL-60细胞为悬浮细胞,置于二氧化碳培养箱,每2 d换1次培养液,细胞密度占瓶底近80%时,离心收集细胞,根据不同实验,调配细胞浓度,置于相应的孔板里,

1.4 细胞存活率的检测

将对数生长期的HL-60细胞,以每孔1×104个/mL的细胞数接种于96孔板中,12 h后开始处理,加入不同浓度LBP,每个浓度设3个平行孔,24 h后分别取出培养板,倒置光学显微镜下观察细胞形态。加入20 μL CCK-8,在培养箱中继续孵育4 h后在酶标仪上检测,以空白组调零,检测波长为450 nm,参照波长为 630 nm,测定各孔吸光度值,取3个复孔的平均吸光度值作为该浓度条件下的OD值。试验重复3次,取平均值。计算细胞存活率,公式：细胞存活率(%)=[(实验组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)]×100%。

1.5 流式细胞术检测不同浓度的LBP对HL-60细胞吞噬功能的影响

取对数生长期的HL-60细胞,将细胞移入24孔板(每孔约1×105个/mL)中,设置空白组和LBP组,空白组不做任何处理,LBP组加入不同浓度的LBP(0,1,10,100,200,500 μg/mL)后,置于37 ℃、5% CO2培养箱中共同孵育24 h后,按1∶10(细胞数量∶E.coli数量)加入FITC标记的E.coli,2 h后将细胞收集、离心后,加入PBS洗细胞,之后加入2%多聚甲醛固定,用流式细胞仪测定吞噬率。

1.6 Western blot检测p-Akt蛋白的表达

取对数生长期的HL-60细胞,将细胞移入6孔板(每孔约50×105个/mL)中,设置对照组和LBP组,对照组不作任何处理,LBP组加入LBP(200 μg/mL),继续刺激24 h,收集细胞后,加入新配制的细胞裂解液,在冰上裂解后收集上清并进行蛋白样本制备。将样品加入电泳孔进行SDS-PAGE电泳,200 mA条件下转膜至PVDF膜上,后加入5%快速封闭液室温封闭2 h,滴加一抗p-Akt(1∶1 000),Akt(1∶1 000),GAPDH(1∶50 000),4 ℃孵育过夜,TBST清洗3次,每次10 min,滴加对应辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔和羊抗鼠二抗(1∶1 000),室温封闭2 h,TBST清洗3次,每次10 min,ECL试剂盒显影,以GAPDH为内参照,使用Image J软件对图像的灰度值进行分析。

1.7 流式细胞术检测PI3K/Akt信号通路与吞噬功能的关系

取对数生长期的HL-60细胞,将其接种于24孔板(每孔约1×105个)中,设置对照组、LBP组和LBP+Wortmannin组。对照组不作任何处理,LBP组加200 μg/mL LBP,LBP+Wortmannin组首先加入PI3K特异性抑制剂Wortmannin(1 μmol/L)2 h后,再加入200 μg/mL LBP继续刺激24 h,之后按1∶10(细胞数量∶E.coli数量)加入FITC标记的E.coli,2 h后将细胞收集、离心后,加入PBS重悬细胞,之后加入2%多聚甲醛固定,用流式细胞术测定吞噬率。

1.8 流式细胞术检测HL-60细胞表面受体表达情况

取对数生长期的HL-60细胞,将其接种于24孔板中(每孔约1×105个),设置对照组、同型对照组和LBP组,对照组和同型对照组未加LBP,LBP组加200 μg/mL LBP,然后置于37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育24 h,之后将各组细胞收集到离心管中,调整细胞浓度为1×106个/mL,吸取100 μL重悬液到流式管中,同型对照组分别加入PE-Rat IgG2a kappa Isotype Control、PE-Rat IgG2b kappa Isotype Control、PE-Rat IgG1 kappa Isotype Control,LBP组分别加入PE-CD36、PE-CD204、PE-CD209、PE-Dectin、PE-MARCO抗体冰上避光孵育30 min,PBS洗涤2遍,然后2%多聚甲醛固定,流式细胞术检测细胞表面受体表达情况。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度的LBP处理对HL-60细胞存活率的影响

CCK-8实验结果显示,使用不同浓度的LBP作用于HL-60细胞24 h后,与0 μg/mL LBP相比,1,10,100,200,500 μg/mL LBP对细胞存活率无明显影响(P>0.05,见图1)。因此上述浓度的LBP可以用于后续实验,不会产生细胞毒性。

图1 CCK-8法检测不同剂量LBP对HL-60细胞存活率的影响Figure 1 Effect of different concentrations of LBP on the viability of HL-60 cells assessed by CCK-8 assay

2.2 LBP促进HL-60细胞吞噬E. coli

采用不同浓度的LBP刺激HL-60细胞24 h后,与0 μg/mL相比,1,10,100,200 μg/mL HL-60细胞吞噬E.coli的功能明显增强(见图2)。当LBP的刺激浓度为200 μg/mL时,HL-60细胞吞噬E.coli功能最强(P<0.01,见图2)。

图2 LBP促进HL-60细胞吞噬E. coli功能Figure 2 LBP promotes the phagocytosis of E. coli in HL-60 cells

2.3 LBP通过PI3K/Akt途径促进HL-60细胞吞噬E. coli

HL-60细胞受200 μg/mL LBP刺激24 h后,Western blot结果显示p-Akt蛋白表达量明显增加(P<0.05,见图3),说明LBP激活了HL-60细胞PI3K信号通路。流式细胞术结果显示,使用PI3K特异性阻断剂,LBP促进HL-60细胞吞噬E.coli功能部分被抑制(P<0.05,见图3),提示LBP通过激活PI3K/Akt通路来促进HL-60细胞吞噬E.coli。

2.4 LBP对HL-60吞噬受体表达的影响

LBP促进HL-60细胞吞噬E.coli功能升高,可能涉及LBP上调HL-60细胞吞噬相关受体,因此我们检测了HL-60细胞表面与吞噬E.coli相关的受体。流式细胞术检测结果表明,与对照组相比,LBP组HL-60细胞表面CD204、CD209、Dectin、CD36受体没有明显变化(P>0.05),但MARCO受体表达明显升高(P<0.05,见图4),这说明LBP促进HL-60细胞吞噬E.coli功能升高可能涉及MARCO受体。

3 讨论

吞噬功能是一个高度复杂的生物学过程,它通过清除外界细菌、真菌等病原微生物,从而发挥抗感染的作用。中性粒细胞是人类血液中主要的吞噬细胞,也是迁移到炎症部位的第一批白细胞,在机体抗感染方面发挥尤为重要的作用。

LBP因其具有多种生物学活性受到广泛关注。目前LBP多用于抗肿瘤[14]、抗氧化[15]、抗衰老[16]、保肝[17]等方面的研究。一些研究表明LBP也具有抗感染作用,如王莹等[18]发现LBP可提高RAW264.7细胞的吞噬功能;高翔[19]发现LBP能够提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力,从而增强机体的免疫功能。本研究中我们也发现LBP能促进HL-60细胞吞噬E.coli功能。研究表明PI3K/Akt信号通路参与细胞吞噬功能的调控,有研究表明胰岛素样生长因子1(IGF-1)通过激活PI3K/AKT信号通路增强小鼠BV-2小胶质细胞的吞噬功能[20,21]。本研究发现LBP刺激HL-60细胞后p-Akt蛋白表达增加,并且使用PI3K阻断剂抑制该通路后,LBP促进HL-60细胞吞噬E.coli功能被抑制,说明PI3K/Akt信号通路在HL-60细胞吞噬E.coli功能中的重要作用。

LBP促进HL-60细胞的吞噬功能,可能涉及其上调HL-60细胞吞噬相关受体的表达。吞噬相关受体主要包括C型凝集素家族成员和清道夫受体(SR)。C型凝集素受体主要包括CD209、识别β-葡聚糖的Dectin家族和识别甘露糖侧链的甘露糖受体(MR);清道夫受体家族主要包括SR-A家族中的CD204和MARCO受体及SR-B家族成员CD36[22,23]。这两类受体都是重要的模式识别受体,可参与介导病原体的识别与清除[24],在宿主防御病原体、脂质代谢等方面发挥作用[25]。本研究发现LBP刺激HL-60细胞表面这两类受体中的CD204、CD209、Dectin、CD36均无明显变化,但清道夫受体A家族中的MARCO受体表达上调,提示MARCO受体可能在LBP提升HL-60细胞吞噬E.coli过程中发挥作用。基因富集分析也发现MARCO受体与PI3K/AKT信号通路之间存在显著相关性[26]。LBP上调HL-60细胞MARCO受体表达的机制还不甚清楚,有待进一步研究。

综上所述,本研究证明LBP通过PI3K/Akt信号促进HL-60细胞吞噬E.coli,并且这种吞噬功能的提高可能与MARCO受体表达上调相关。这说明了LBP具有抗感染功能的机制,也丰富了LBP的生物学功能,对进一步开发LBP的药用价值提供了实验依据。