石榴皮提取物通过抑制炎症和氧化应激改善小鼠结肠炎

鹿欣雨,高 敏,李海燕,李丹凤,黄凤霞,王 琳

(1西安医学院医学技术学院医学检验实验中心,西安 710021;2西安医学院医学技术学院;3西安医学院药学院化学实验中心;*通讯作者,E-mail：luxyu28nn@163.com)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种慢性、复发性肠道炎症疾病,临床症状以腹泻、发烧、腹痛、血便、食欲下降和体质量减轻为主,直肠和结肠黏膜反复出现的炎症性病变可能会引发结肠癌[1]。UC的发病机制尚不完全清楚,炎症和氧化应激在UC的疾病进程中发挥着关键作用[2]。免疫系统的失衡会促进活性氧的产生[3,4],进一步导致肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素17(IL-17)、干扰素γ(IFN-γ)等促炎性细胞因子的释放,最终加重氧化应激和肠上皮细胞损伤[5]。

目前UC的常规治疗药物具有一定的局限性和副作用[6],而天然植物提取物疗效更高,副作用更小[7,8]。石榴皮富含多酚类化合物,主要由酚酸、鞣质和类黄酮组成,为我国传统中药,具有治疗腹泻、痢疾、感染性炎症等作用[9,10]。据报道,在刀豆球蛋白A诱导的自身免疫性肝炎小鼠模型中石榴皮提取物(pomegranate peel extract,PPE)能减轻肝脏炎症并降低TNF-α、IFN-γ和IL-6的分泌[11];本课题组前期研究表明,在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型中,口服PPE能通过降低中枢和外周CD4+IL-17+、CD4+IFN-γ+等炎性细胞因子的分泌,增加免疫调节细胞因子的表达来减轻EAE的严重程度[12],然而,PPE在UC中的潜在价值还需进一步挖掘。本研究旨在探讨PPE对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的UC小鼠的治疗作用和分子机制,为PPE在UC治疗中的作用提供药理学基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 6～8周雌性C57BL/6小鼠购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,许可证号：SCXK(京)2019-0010,小鼠适应动物实验室4 d,饲养于标准动物室,湿度40%～60%,温度(20±5)℃,并提供标准食品和蒸馏水。所有动物实验均经西安医学院伦理审查委员会批准(批准编号：XYLS2023085),并按照批准的机构指南和规定进行。

1.1.2 主要试剂与仪器 石榴皮来源于陕西临潼农家石榴园石榴PunicagranatumL.的干燥果皮。福林酚试剂购自北京索莱宝科技有限公司;安石榴苷、没食子酸、鞣花酸(分析对照品,HPLC≥98%)购自成都德斯特生物技术有限公司;葡聚糖硫酸钠、粪便隐血试剂盒购自上海翌圣生物科技有限公司;RNA样本保存液、细胞/组织RNA快速提取试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司;反转录酶、SYBR Green qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。高效液相色谱仪购于美国Thermo公司,正置显微镜购于德国Leica公司。

1.2 实验方法

1.2.1 PPE的制备及总酚含量测定 新鲜石榴皮经水清洗烘干粉碎,过滤得石榴皮粉末。称取石榴皮粉末1 g置于50 mL离心管中,加入30 mL 60%乙醇溶液,静置过夜后进行超声波辅助提取30 min并离心,收集上清液在40 ℃水浴条件下旋转蒸发,将旋蒸后的液体置于-80 ℃中冷冻48 h后用冷冻干燥机冷冻烘干得到PPE粉末。采用Folin-Ciocalteau法计算PPE总酚含量[13],取没食子酸对照品溶液,配制成浓度为0.01,0.02,0.03,0.04,0.05 mg/mL的对照品溶液。分别取不同浓度的没食子酸对照品溶液和PPE溶液0.8 mL置于10 mL棕色容量瓶,依次加入4 mL蒸馏水、0.4 mL福林酚试剂、4.8 mL 29%的碳酸钠溶液,充分混合,静置30 min后在760 nm的波长处测量吸光度。纵坐标表示吸光度,横坐标表示浓度,制备没食子酸标准曲线并计算线性方程。

1.2.2 高效液相色谱法分析PPE成分 根据对照品在检测波长254 nm处响应值高低的不同,将没食子酸、安石榴苷、鞣花酸对照品以适当比例混合,配制成混合对照品溶液。精密称定10 mg PPE粉末,加10 mL甲醇超声溶解,摇匀滤过,即得样品溶液。赛默飞高效液相色谱仪U3000,色谱柱Waters Symmetry-C18(4.6 mm×250 mm,5.0 μm),流动相分别为：A-乙腈,B-0.1%磷酸水溶液,洗脱程序[14]：0～35 min 2%～8% A,35～47 min 8%～18% A,47～55 min 18%～20% A,柱温35 ℃,进样量3 μL,流速1.0 mL/min。

1.2.3 动物分组及处理 将实验小鼠随机分为正常组、模型组、PPE低剂量组和PPE高剂量组,每组6只。正常组小鼠自由用水。模型组和PPE各组小鼠均连续7 d给予3%的DSS饮用水,第8天接受正常饮用水。从DSS造模给药第1天起,正常组和模型组每日均以蒸馏水灌胃,PPE各组分别给予200 mg/kg和400 mg/kg的PPE灌胃,连续10 d,每日固定时间给药1次。第11天结束实验脱颈处死小鼠,迅速取出结肠并测量其长度;取1 cm的远端结肠进行苏木精和伊红染色(hematoxylin-eosin,HE);取部分结肠组织置于装有RNA保存液的离心管,存于-80 ℃进行RT-qPCR,检测TNF-α、IL-17A、IFN-γ的表达水平;再取部分结肠组织于-80 ℃保存,后续检测氧化应激标志物。

1.2.4 疾病活动指数评估 从造模第1天起,每天对小鼠的体质量、大便性状和血便进行记录和评分。根据疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分标准[15](见表1),两名实验人员对造模小鼠进行双盲评分,最终取体质量下降百分比、大便性状和血便评分的平均值作为DAI评分,并统计评分结果。

表1 DAI评分标准

表2 RT-qPCR引物序列

1.2.5 RT-qPCR检测结肠炎性细胞因子(TNF-α、IL-17A、IFN-γ)的表达 按动物/组织RNA提取试剂盒说明书步骤提取RNA,并用核酸蛋白仪(Nono-

1.2.6 HE检测各组小鼠结肠组织的病理变化 结肠组织用4%多聚甲醛固定,经脱水和包埋后用石蜡轮转切片机切为6 μm薄片,结肠切片用HE进行组织学分析,在光学显微镜下观察切片并拍照分析。组织学评分0～4分,依据为上皮损伤(0分,无组织损伤;1分,局部损伤;2分,中度损伤,3分,重度损伤)、隐窝损失(0分,无损失;1分,轻度;2分,中度;3分,重度;4分,无隐窝)、绒毛损伤(0分,无;1分,轻度;2分,中度;3分,重度;4分,完全损伤)、炎症细胞浸润程度(0分,无;1分,隐窝周围轻度浸润;2分,黏膜肌层出现浸润;3分,黏膜肌层普遍浸润;4分,严重浸润)[16]。

1.2.7 结肠组织氧化应激标志物(MDA、SOD、GPX)活性测定 结肠组织用生理盐水匀浆,3500 r/min,4 ℃下离心10 min收集上清。结肠中MDA、SOD、GPX活性根据试剂盒方法测定。

1.2.8 统计学分析 采用GraphPad Prism 8统计软件对数据进行绘图和分析,数据以平均值±标准误表示。两组间比较采用独立样本t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PPE总酚含量及主要成分分析

没食子酸对照品溶液浓度在0.01～0.05 mg/mL线性关系良好,标准曲线回归方程为y=2.150 2x+0.052 1,R2=0.998 6,测得PPE中总酚含量为(295.76±3.15)mg/g。PPE样品色谱图与混合对照品色谱图对比显示样品中含有没食子酸、安石榴苷及鞣花酸,其中安石榴苷以同分异构体(安石榴苷A和B)存在(见图1),化合物色谱信息分析结果显示安石榴苷峰面积的百分比最高(见表3)。

注：1.没食子酸;2.安石榴苷A;3.安石榴苷B;4.鞣花酸。图1 混合对照品和PPE样品色谱结果Figure 1 Chromatogram of mix-standard sample and PPE sample

表3 PPE样品色谱信息

2.2 PPE对UC小鼠体质量、DAI指数和结肠长度的影响

与正常组相比,模型组和PPE各组小鼠从DSS造模给药第3天开始陆续呈现活动减少、软便、腹泻和体质量下降趋势,表明UC模型已成功建立。与正常组相比,模型组小鼠体质量降低(P<0.01),DAI指数增加(P<0.000 1),结肠长度缩短(P<0.01);在第7天时,与模型组相比,PPE低剂量组和高剂量组体质量均无统计学意义(P>0.05),DAI指数均降低(P<0.01);在第11天时,与模型组相比,PPE低剂量组体质量下降程度缓解(P<0.01),PPE高剂量组体质量仍无统计学意义(P>0.05),DAI指数均降低(P<0.01,见图2)。此外,与模型组与相比,PPE低剂量组和高剂量组小鼠结肠缩短程度均得到明显改善(P<0.05,见图2)。提示PPE能缓解结肠炎的严重程度。

注：与正常组比较,**P<0.01,****P<0.000 1;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。图2 PPE对UC小鼠体质量、DAI指数和结肠长度的影响Figure 2 Effects of PPE on body weight, DAI score, and colon length in mice with DSS-induced colitis

2.3 PPE对UC小鼠结肠组织病理学的影响

正常组小鼠结肠上皮细胞和隐窝结构完整,杯状细胞没有减少,组织学评分也最低;与正常组相比,模型组出现上皮损伤、杯状细胞丢失、炎性细胞浸润、隐窝结构破坏情况,组织学评分较高(P<0.000 1);与模型组相比,PPE低剂量组和高剂量组小鼠黏膜损伤较少,隐窝结构破坏程度减轻,炎性细胞浸润明显减少,组织学评分降低(P<0.05,见图3)。由此可见,PPE对UC小鼠结肠黏膜损伤有明显的改善作用。

2.4 PPE对炎性细胞因子表达的影响

与正常组相比,模型组TNF-α、IL-17A和IFN-γ的表达水平增加(P<0.05);与模型组相比,PPE低剂量组和高剂量组结肠组织中TNF-α、IL-17A和IFN-γ的表达水平均下调(P<0.05,见图4)。以上结果表明PPE给药可以有效逆转炎性细胞因子的异常产生。

注：与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。图4 PPE对UC小鼠结肠组织促炎细胞因子的影响Figure 4 Effects of PPE on pro-inflammatory cytokines in colon tissues of mice with DSS-induced colitis

2.5 PPE对氧化应激标志物的影响

与正常组相比,模型组小鼠结肠组织中MDA浓度升高(P<0.01),SOD和GPX活性降低(P<0.01);与模型组相比,PPE低剂量组和高剂量组小鼠结肠MDA水平均明显降低(P<0.01),SOD水平差异无统计学意义(P>0.05),同时PPE低剂量组小鼠GPX水平增加(P<0.05),而PPE高剂量组GPX活性未见统计学差异(P>0.05,见图5)。表明PPE可以通过降低MDA水平、增加SOD和GPX活性来抑制氧化应激。

3 讨论

UC是一种常见的胃肠道疾病,由于其病因的复杂性,预防和治疗该疾病的有效方法仍然很有限。因此,迫切需要开发新的安全有效的治疗药物。石榴皮来源天然,安全性较高,具有极高的开发价值。本研究表明PPE能明显改善DSS诱导的结肠炎小鼠的DAI评分、结肠长度缩短和组织病理学损伤情况,且低剂量的PPE(200 mg/kg)改善UC的治疗效果更为显著,我们推测可能由于PPE中所含的有效成分在高浓度时会刺激肠道从而减弱UC的治疗效果。

炎性细胞因子的分泌在肠道免疫系统和UC的病理生理中起着关键作用。巨噬细胞、树突状细胞和T细胞来源的TNF-α在UC中具有刺激中性粒细胞并启动其他细胞因子分泌的作用[17];Yang等[18]证实IFN-γ信号通路及其核心基因在UC表型中上调并促进免疫炎症反应的加重;IL-17A是一种有效的促炎细胞因子,可通过促其他炎症介质(如TNF-α、IL-6)的释放以及诱导中性粒细胞相关基因参与炎症过程[19]。因此,抑制这些促炎细胞因子的分泌可以减轻UC。据报道许多植物提取的多酚可以降低炎性细胞因子的水平,从而减弱炎症反应,例如,咖啡樱桃壳多酚、紫山药多酚、青豌豆壳多酚提取物通过降低DSS诱导的小鼠结肠组织中IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A等其他促炎细胞因子的水平来改善结肠炎[20-22]。本研究结果与此一致的是,与模型组相比,PPE低剂量组和高剂量组小鼠结肠组织中TNF-α、IFN-γ、IL-17A水平降低,表明PPE治疗能抑制促炎细胞因子的表达,有效改善炎症反应。

氧化应激也是UC发病的潜在机制,炎性细胞浸润产生的自由基会破坏内源性防御系统和上皮细胞的完整性,诱发肠黏膜免疫功能障碍,延缓肠黏膜恢复,而SOD与GPX的协同作用可以保护结肠黏膜免受过氧化物引起的损伤[4]。DSS诱导的氧化应激和脂质过氧化通常表现为MDA含量增加以及GPX、SOD活性降低[23]。同样,本研究中,与模型组相比,PPE低剂量组和高剂量组结肠组织中MDA水平降低,SOD和GPX活性提高,而且PPE低剂量组抗氧化能力高于PPE高剂量组,可能是由于多酚在高剂量给予时会充当促氧化剂[24]。

综上所述,PPE可以通过降低炎性细胞因子表达水平,调节氧化应激来改善DSS诱导的结肠炎。因此,PPE可以作为一种有潜力的天然抗炎、抗氧化剂,为UC等炎症性疾病的预防、治疗和药物开发提供研究基础。