蝴蝶轻元素稳定同位素比值的测定

傅慧敏,苏芝敏,2*,王巧环,孟 龄

(1.中国科学院生态环境研究中心 城市与区域生态国家重点实验室,北京 100085;2.北京京津冀区域生态环境变化与综合治理国家野外科学观测研究站,北京 100085)

蝴蝶对环境的依赖程度较高,其生存环境的气候变化、食物来源等都会直接影响区域内蝴蝶的种类和数量,因此蝴蝶可作为研究生态环境的指标[1-2]。国内对蝴蝶的研究主要是以采集后分类为主,较少用稳定同位素技术判定蝴蝶的生活习性。研究表明,昆虫的稳定同位素比值可以直观地展现昆虫的迁徙、食物来源、营养级、溯源等信息[3-12]。目前昆虫的稳定同位素比值检测,一般选用全虫[4,12]或者头部[13]、腿部[14]、翅膀[15]等不同部位进行脱脂或不脱脂处理[8,16],脱脂试剂一般为不同体积比的甲醇-三氯甲烷的混合溶液[4,7-8,17],没有统一明确的试验方案,而昆虫的选择部位和前处理有可能会影响数据的可靠性。

本工作选用个头较大的活大帛斑蝶,对其不同部位和经不同配比的脱脂试剂脱脂后的翅膀进行轻元素稳定同位素比值(δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值)的测定,考察差异性,从而确定蝴蝶轻元素稳定同位素比值的测定方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Flash EA 2000 HT型元素分析仪;DELTA V Advangtage型稳定同位素比质谱仪。

甲醇为色谱纯;三氯甲烷为分析纯;试验用水为超纯水。

5种标准物质见表1(V-PDB表示碳稳定同位素的标准物质;AIR表示氮稳定同位素的标准物质;V-SMOW表示氧、氢稳定同位素的标准物质);5只人工养殖的同批次活大帛斑蝶购自同一网店,编号S1～S5。

表1 标准物质

1.2 仪器工作条件

利用元素分析仪,碳、氮元素经燃烧还原分别转化成CO2和N2,氢、氧元素经高温裂解分别转化为H2和CO。待测元素转化为目标气体后,由连续流接口引入稳定同位素比质谱仪;各待测元素稳定同位素比值的仪器工作参数见表2。

表2 仪器工作参数

1.3 试验方法

1.3.1 样本预处理

将活蝴蝶样本用少量水冲洗,自然风干。用镊子和剪刀将每只蝴蝶分解成6个部分：头部、左翅、右翅、腿部、胸部、腹部,然后分别放置于干净的烧杯中。

未脱脂处理：将头部、左翅、腿部、胸部、腹部样本放置于60 ℃的烘箱中烘干,研磨并储存于密封性好的玻璃瓶中,其中左翅部位烘干后先剪碎再研磨。

脱脂处理：用水浸泡右翅样本30 min,再用体积比2…1的甲醇-三氯甲烷混合溶液(A)或体积比1…2的甲醇-三氯甲烷混合溶液(B)浸泡2 h; 弃去混合溶液,用水清洗两次并浸泡30 min,再用A或B浸泡2 h,取出,用水清洗3次,置于60 ℃烘箱中烘干,剪碎后研磨,并储存于密封性好的玻璃瓶中。

1.3.2 稳定同位素比值的测定

考虑到不同元素需要的样本量可能不同,若选择一次进样多元素同时测定,则需要利用氦气稀释过量的气体产物,这会引起测定误差。为了避免稀释带来误差,预试验发现测定δ13C值需要0.08 mg样本,测定δ15N值需要0.40 mg,测定δ2H和δ18O值均需要0.20 mg。因此,分别称取约0.08,0.40 mg研磨好的样本包入锡杯中,用于δ13C和δ15N值的测定;称取约0.20 mg样本包入银杯中,用于δ2H和δ18O值的同时测定。

2 结果与讨论

2.1 校准曲线

同位素测定数据的校正可采用两点或多点法(两个或多个标准物质)[18],因此试验选用B2203、B2205、CBS这3种标准物质校正δ2H和δ18O值,选用B2157、B2205、IVA33802174这3种标准物质校正δ15N和δ13C值。以仪器测定值为横坐标,各元素稳定同位素比值的标准值为纵坐标绘制校准曲线,结果见表3。

表3 校准曲线

2.2 样本分析

按照试验方法对5只蝴蝶样本进行预处理和测定,每个样本取两份,结果见表4。为了比较不同部位的稳定同位素比值差异,首先对各组数据进行正态分布检验。δ13C和δ15N值不满足正态分布条件,因此采用Kruskal-Wallis(克鲁斯卡尔-沃利斯)检验判定不同部位之间的差异显著性,差异达到显著水平(P<0.05)时采用Tukey法进行多重比较;δ18O和δ2H值满足正态分布条件,因此采用One way ANOVA(单因素方差分析)判定不同部位之间的差异显著性,差异达到显著水平(P<0.05)时采用Holm-Sidak法进行多重比较,结果见表4;其中同一行不含相同字母的部位表示差异达到显著水平(P<0.05)。

表4 蝴蝶不同部位的稳定同位素比值

由表4可知：蝴蝶不同部位的δ13C和δ2H值差异分别达到显著(P<0.05)和极显著(P<0.001)水平;蝴蝶翅膀的δ13C值最高,右翅(B)与头、胸、腹三个部位之间的δ13C值差异达到显著水平,头、胸、腹部位之间的δ13C值没有显著差异;蝴蝶腹部的δ2H值最高,且与其他部位的δ2H值均有显著差异,而其他部位之间的δ2H值没有显著差异;左翅和右翅(A、B两种脱脂处理)的δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值的测定结果均无显著差异,可见对翅膀脱脂与否,以及两种配比的脱脂试剂对δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值的测定结果无影响。这些现象可能是因为内脏器官的存在以及蝴蝶摄取食物的差异而产生的。

当需要利用稳定同位素技术分析蝴蝶的食源、分布以及迁徙活动等信息时,直接将其翅膀或腿部烘干、粉碎研磨后取样进行检测,无需进行脱脂处理,以减少有机试剂对环境的污染;若是需要对蝴蝶食源进行研究,建议取其腹部内容物进行检测。