性状鉴别联合InDel标记检测快速鉴定柑桔品种

刘小丰,王 洪,刘梦雨,朱世平,江 东,曹 立,余 歆

[1 西南大学柑桔研究所/国家柑桔工程技术研究中心,重庆,400712;2 西部(重庆)科学城种质创制大科学中心,重庆,401329]

我国是柑桔种植大国,柑桔种植面积超过300 万hm2(4 500万亩),产量超过4 600万t(数据来自FAOSTAT,2021)。我国也是柑桔品种大国,当前在生产中栽种的柑桔品种超过100个,其中67个品种年产量超过1万t,30个品种超过10万t,6个品种和3个品种群超过100万t[1]。随着我国柑桔产业的快速发展,国内柑桔新品种选育热度持续增加。自1997年10月1日实施《中华人民共和国植物新品种保护条例》以来,我国共颁布柑桔新品种保护申请公告208份,授权公告78份;自2017年5月1日开始实施《非主要农作物品种登记办法》以来,已完成84个柑桔品种登记(数据来自中国种业大数据平台)。与此同时,围绕柑桔品种侵权、假冒等不法行为时有发生,如“中柑所5号”和“龙回红脐橙”品种权侵权行政执法案分别列入2021和2023年度农业农村部农业植物新品种保护十大典型案例[2]。

基于形态特征的特异性(可区别性,Distinctness)、一致性(Uniformity)和稳定性(Stability)测试(简称DUS测试),通过品种性状特征的描述和三性判断来定义品种,是国际植物新品种保护联盟(UPOV)授予品种权的依据[3]。自2016年1月1日实施的《中华人民共和国种子法》要求申请保护、审定和登记的品种应当具备DUS,并且明确DUS测试是植物品种管理的基本技术依据。因此,DUS测试是受到国际认可的、具备法律依据的植物品种定义方法。开展DUS测试需要将测试品种和近似品种相临种植,为确保观测到的性状有足够的一致性,通常需要进行至少两个独立的生长结果周期的测试[4-5]。柑桔是多年生木本作物,生长周期长,从嫁接到开花结果通常需要2～3年以上。同时,柑桔遗传背景复杂,杂合度高,受环境影响较大,性状表达一致性不及大田作物。在品种保护实践中,品种权人通常希望在较短时间内判定品种是否受到侵权,但受采样时间限制,往往难以采集到DUS测试所需的不同时期、不同部位的全部性状,导致DUS测试在果树品种权保护过程中执行困难。

分子标记是以核酸序列变异为基础的遗传标记,通过分子标记检测可快速、准确、客观、不受环境条件干扰地区分品种,在已知品种鉴定和遗传多样性分析中发挥着不可替代的作用[3]。在农作物研究中,基于简单序列重复的SSR标记是最受欢迎的标记技术。近年来,随着高通量测序技术的发展和普及,基于全基因组重测序数据得到的SNP标记和InDel标记,因密度大、多态性丰富、准确性高、位点明确等诸多优势,成为新热点[6-7]。特别是大片段(>30 bp)InDel标记,利用中浓度(1.5%～3%)琼脂糖凝胶电泳就能很好地区分出差异性条带,可方便、有效地应用于遗传分析和品种鉴别。尽管分子标记在品种鉴定中应用前景广泛,但它针对的是标准品种的符合性检测,且很难成功鉴定部分芽变、回交、高世代分离选种等育种方式获得的品种[3]。而芽变选种是仍然是当前柑桔新品种选育的重要方式,如温州蜜柑、甜橙类品种群多为芽变产生[8],利用当前的分子标记技术难以辨别,仅依赖分子标记结果难以认定未知品种。

为了探索快速、可靠的柑桔品种鉴定方法,以5个未知柑桔品种为待测材料,进行了性状鉴别联合InDel标记检测的鉴定研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

5个柑桔待测材料取自广西壮族自治区灵川县某果园。据业主反映,该批果苗按091无核沃柑(Citrus reticulataBlanco ‘091 Seedless Orah’)品种购进和种植,但其果实成熟后酸度明显高于沃柑(C. reticulataBlanco ‘Orah’)和091无核沃柑,因此被认定为未知品种。在2023年4月上旬,随机采集春梢及叶片、花和成熟果实作为鉴定材料,低温冷藏送至实验室。3个对照品种[爱媛28(C. reticulataBlanco ‘Ehime Kashi No.28’)、红桔(C. tangerina)和纽荷尔脐橙(C. sinensisOsbeck ‘Newhall’)]和2个近似品种[091无核沃柑和无核金诺(C. reticulataBlanco ‘KinnowLS’)]的试验材料同期采集自国家柑桔种质资源圃(重庆)。

1.2 试验方法

1.2.1 性状鉴别 从《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 柑桔(NY/T 2435—2013)》所列113个测试性状中选择101个性状(质量性状20个,数量性状62个,假质量性状19个)对测试品种进行测试,其他12个性状[树姿、外种皮颜色、内种皮颜色、种子合点颜色、种子子叶颜色、种子胚性、花萼直径、花瓣长度、花瓣宽度、花瓣指数、雄蕊数量和果实种子数量(人工自交授粉)]因未获取而未进行测试。测试品种性状测试完成后,先与国家柑桔种质资源圃(重庆)数据库的品种性状进行对比,获得最为近似的品种,然后对近似品种采样观测相应性状,比较测试品种与近似品种之间性状的差异。

1.2.2 基因组DNA提取和PCR扩增 使用CATB法从柑桔叶片中提取基因组DNA[9]。取50 mg新鲜叶片,液氮研磨粉碎后加入700 μL CTAB抽提缓冲液,振荡混匀后于65 ℃孵育30 min,中间颠倒混匀3～5次。氯仿-异戊醇(24∶1,体积比)抽提1～2次,上清液用0.7倍体积的异丙醇沉淀DNA,75%乙醇清洗2次后风干。DNA沉淀用100 μL ddH2O溶解,加入1 μL RNase A溶液(10 mg/mL,索莱宝),37 ℃孵育30 min去除RNA。Nanodrop 2000分光光度计(Thermo Scientific,美国)检测DNA浓度和质量,当DNA浓度大于50 ng/μL且OD260/OD280和OD260/OD230在1.8～2.1时,方可用作PCR扩增模板。利用筛选的33个分布于9条柑桔染色体上的InDel分子标记(另文发表),对供试柑桔材料的DNA进行PCR扩增。反应体系为:2× Taq PCR Mix(NO. B639295,生工)10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 8.2 μL。反应程序为:95 ℃预变性180 s;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃ 120 s。PCR产物用含1/10 000 TS-GelRed(TSJ003,艾得莱)的1.5%琼脂糖电泳分离,Quantum ST5凝胶成像系统(VILBER,法国)拍照记录。

1.2.3 聚类分析 根据InDel标记扩增条带电泳结果,在相同的迁移位置上,有带的记为1,无带的记为0,构建“0,1”矩阵。采用NTSYSpc2.10 e软件计算品种间的遗传相似系数,进行非加权组平均法(UPGMA)聚类分析,绘制树状图[10]。

2 结果与分析

2.1 性状鉴别

性状鉴别结果显示,5个测试品种在性状上没有明显差异。其主要性状特征为:春梢有刺,数量少,长度中,节间长度中;嫩叶无花青甙显色,叶长度6.12～6.85 cm,叶宽度2.92～3.18 cm,叶形指数2.03～2.22,叶片呈阔披针形,叶尖端渐尖,有缺刻,叶基楔形,叶横截面形状中凹,扭曲程度中,叶背无茸毛,叶柄长度中,无翼叶;花无花青甙显色,花瓣白色;果实纵径4.10～4.43 cm,横径5.07～5.50 cm,果形指数0.80～0.83,单果质量59.26～72.40 g,果实最宽处在中部,果基、果顶稍圆,无凹陷,有放身状沟纹,沟纹数量少、长度短,无果颈,无颈领,无果顶乳突,无花柱宿存,无果脐,果面呈黄橙色、无杂色,果面光泽中、光滑度中、无凹点,油胞凸、大小中、明显度中,花柱痕直径中,香气弱;果皮厚0.28～0.30 cm,剥皮难易度中,韧度中,剥皮溢油量中,白皮层颜色为浅橙色,果肉颜色深橙色,无苦味,果心半充实,中心柱大小中,囊瓣整齐,囊瓣数10～11,分瓣难易度中,囊壁薄,汁胞紧实度中、长度短,果肉细嫩化渣,果汁含量中,可溶性固形物含量为15.7%～19.3%,果汁含酸量0.75%～0.86%,可食率高,种子数量1～2颗;一年开花一次,可单性结实,晚熟。

将以上性状数据与国家柑桔种质资源圃(重庆)数据库数据比对,发现测试品种与091无核沃柑和无核金诺最为相似。在101个比对性状中,测试品种与091无核沃柑有4个差异性状(序号为28、49、54和111的性状),与无核金诺有1个差异性状(序号为28的性状)(见表1)。在差异性状中,28和111号性状为群体测量的数量性状,49和54号性状为群体观察的假质量性状,即测试品种与近似品种在质量性状上无差异。尽管测试品种与091无核沃柑之间果实质量、果汁含酸量性状表达代码的差值均达2,但考虑到气候条件、栽培技术等因素的不同,不宜直接断定存在特异性(可区分性);同理,尽管测试品种与无核金诺之间仅在果实质量性状上有差异且表达代码的差值只有1,但不宜断定两者为同一品种。果实外观见图1。

图1 5个测试品种与091无核沃柑和无核金诺果实外观

表1 测试品种与近似品种差异性状比较

2.2 InDel分子标记检测

分别提取5个测试品种、2个近似品种及3个对照品种(爱媛28、红桔和纽荷尔脐橙)的基因组DNA,用33个分布于9条染色体上的InDel标记检测其多态性。结果表明,26个InDel标记在品种间展现出清晰的多态性(见图2),11个InDel标记在测试品种和近似品种间具有多态性。在检测和对照材料中,23个InDel标记有2条变异条带,1个(I6_681)有1条变异条带,2个(I5_597和I9_459)有3条变异条带。5个测试品种间没有位点差异,它们与性状近似品种无核金诺无位点差异,与性状近似品种091无核沃柑有12个位点的差异,与对照品种爱媛28有25个位点的差异,与对照品种红桔有11个位点的差异,与对照品种纽荷尔脐橙有29个位点的差异。基于InDel标记结果的UPGMA聚类树显示,测试材料与无核金诺聚在一起,它们与红桔和091无核沃柑的遗传距离较近,与爱媛28和纽荷尔脐橙的遗传距离较远(见图3)。

注:1-5:测试品种1-5;6:091无核沃柑;7:无核金诺;8:爱媛28;9:红桔;10:纽荷尔脐橙。

图3 10份柑桔材料(5个测试品种、2个近似品种和3个对照品种)基于26个多态性InDel标记结果的UPGMA聚类

2.3 品种鉴定

结合性状鉴别和InDel标记检测结果,确认测试品种是无核金诺,不是091无核沃柑。

3 讨论

沃柑是晚熟杂柑品种,具备高糖低酸、风味好、易剥皮、耐贮运等多种优势,广受市场欢迎。目前,全国沃柑种植面积已经超过13.3 万hm2(200万亩),仅南宁市武鸣区的种植面积就达3.3 万hm2(50万亩),产值150亿元[11]。一般认为,沃柑由坦普尔桔橙(C. templeHort. ex. Y. Tanaka)和丹西红桔(C. tangerinaHort. ex. Tanaka)杂交而来[12]。Barry等[13]利用柑桔褐斑病(alternaria brown spot)抗性鉴定和23对SSR标记分型后认为,沃柑的父本是金诺,而不是丹西红桔。091无核沃柑是由沃柑辐射诱导而来的无核品种,在保留沃柑的众多优点的同时,克服了沃柑多籽的缺点[14]。无核金诺是由金诺(C. reticulataBlanco)辐射诱导而来的无核突变,金诺由王柑(C. nobilisLour.)和地中海柳叶桔(C. reticulataBlanco)杂交而来。因此,无核金诺与091无核沃柑具有极高的相似性是有迹可循的。

尽管栽培、管理、气候等因素对性状的稳定性存在一定影响,但质量性状和假质量性状的稳定性比数量性状高[15-16]。本研究通过性状鉴别发现,测试品种在叶、花和果的97个性状上与091无核沃柑相似,仅果实质量和果汁含酸量两个数量性状、果面颜色和油胞凹凸两个假质量性状上存在1～2个代码值的差异,而与无核金诺之间仅在果实质量这个数量性状上有差异。因此,通过性状鉴别仅可以推断091无核沃柑和无核金诺是测试品种的近似品种。

分子标记是品种遗传多样性分析和品种管理的有效工具。SSR标记被用于鉴定柑桔杂交品种[17, 18]和构建柑桔资源指纹图谱库[19],AFLP[10]、ISSR[20]、SRAP[21]、SNP[22, 23]、CAPS[24]等标记也被用于柑桔种质资源的分析。随着深度测序技术的发展,大量柑桔基因组数据为InDel的可靠性和易检测性提供了保证。Fang等[25]利用4个柑桔基因组开发了453适合于PCR检测的InDel标记,其中适用于琼脂糖凝胶电泳检测的大片段(30～200 bp)标记占65%。杨程等[26]从柑桔叶绿体基因组中开发出4个InDel标记,它们在48个有代表性的柑桔属及近缘材料中均能扩增出较为清晰的多态性条带,表现出了极高的分辨能力。本研究的33个InDel标记来自杂柑品种基因组测试数据,其中26对引物在试验品种间有多态性,并从两个性状极为相似的品种间检测出12个位点的差异,表明此套InDel标记在柑桔品种鉴定中具有很好的便利性和鉴别能力。

分子标记技术在DUS测试中的应用越来越受到重视[27-29],实现分子距离和表型距离的强关联是分子标记发展的方向。随着测序技术的普及,SNP标记鉴定结果与与性状鉴定结果表现了更好的相关性。Achard等[30]利用5 346个SNP和DUS性状对322份大豆品种进行鉴定,确定品种间96%的SNP相似性代表了具有形态差异和不具有形态差异的分界线。Zhang等[31]利用40个经前期验证过与性状相关的SNP标记和50个DUS测试性状分别对134个黄瓜品种进行鉴定,结果表明SNP标记和DUS测试性状在品种区分水平上呈线性相关。目前,在DUS测试实践中,分子鉴定标准仍以SSR标记为主[4,32-35],但SSR标记数量和鉴定能力有限,往往导致分子距离和表型距离相关性不高。本研究中,测试品种与近似品种091无核沃柑有12个位点的差异,而与对照品种红桔只有11个位点的差异,可能是因为本套InDel标记未能与性状关联有关。因此,继续开发与性状关联的InDel标记是未来研究的方向。

尽管分子标记技术发展迅速,但在品种保护中分子标记仍不能完全取代DUS测试[3]。如:柑桔芽变和诱变育种材料通过性状鉴定十分容易,而分子标记鉴定却十分困难。在中国已登记的84个柑桔品种中,芽变(46个)、辐射诱变(3个)、优良单株(10个)等难以采用分子标记进行鉴定的品种占71.95%。在柑桔芽变鉴定中,AFLP[36-38]和RAPD[39]分子标记技术是早期使用的方法,需要针对不同品种挖掘不同的引物,引物开发相当困难。近年来,胡冬梅等[40]利用Target SSR-seq技术成功鉴定了温州蜜柑芽变,但该技术操作难度极高,在其他类型芽变(如甜橙)或诱导材料中的应用还有待进一步开发。这些分子标记技术针对的是已知来源的芽变品种的鉴定,对于未知或隐瞒来源的芽变品种来说,鉴定仍然相当困难的。因此,目前,在柑桔品种的鉴定中,分子标记作为DUS测试的辅助是具有一定优势的,要实现品种确权,分子标记还需要与DUS测试相结合。

一直以来,缺乏快速准确的鉴定标准是新品种保护困难的重要原因[41]。DUS测试是品种确权的依据,但在柑桔中存在着DUS测试周期过长和近似品种确立困难等缺陷。本研究借助国家柑桔种质资源圃(重庆)超过1 900份柑桔种质资源及其性状数据,通过DUS测试中的部分性状观测,结合分子标记技术检测,实现了快速准确地鉴定柑桔品种,也为准确快速鉴定柑桔品种提供了解决有效方案。