基于TMT蛋白组学分析姜黄素对热应激蛋鸡肝脏抗氧化性能的影响

杨铭宣,刘梦杰,王晋,虞德兵

(南京农业大学动物科技学院,江苏 南京 210095)

长期高温和过度温暖的环境会造成动物的应激反应,直接或间接影响动物各种生理状态,进而影响动物生产性能[1-2]。热应激会促进畜禽机体的产热,从而导致凝血障碍、脑组织损伤、心血管系统功能障碍、内毒素血症、代谢紊乱以及多系统器官衰竭等不良反应产生,对内分泌系统、神经-消化系统、免疫系统和泌尿生殖系统等都会造成影响[3]。研究发现热应激会导致蛋鸡的死亡率增加,饲料效率以及鸡蛋的产量和质量下降[4]。之前有研究表明,高温饲养的蛋鸡与常温饲养相比,活体重(LWG)和饲料转化率(FCR)分别降低了14.6%和14.3%[5]。因此缓解蛋鸡在饲养过程中的热应激现象是养鸡业亟待解决的重要问题之一。

在饲料中添加一些植物提取物,如芦丁、白藜芦醇和茶多酚等是蛋鸡生产中常用的一种抗氧化应激方式。姜黄素(curcumin)是姜黄中的主要成分,姜黄素具有多种生物学特性,包括抗氧化、抗炎、抑制脂质过氧化、抗病毒、抗微生物、抗肿瘤和清除自由基等[6-7]。前人研究发现姜黄素可以抑制脂质过氧化并中和体内的ROS(超氧化物、过氧化氢、羟基自由基),对机体的氧化应激有一定的保护作用[8]。动物试验证明,姜黄素可提高家禽免疫机能,同时还可以起到改善脂类代谢和肠道健康,提高生产性能等作用。胡忠泽等[9-10]研究发现,日粮中添加姜黄素能显著提高肉鸡的日增重和采食量,降低料重比,能显著促进肉鸡胸腺的生长发育和增加血清中免疫球蛋白的含量。近几年,姜黄素被发现可以缓解肉鸡养殖过程中的热应激反应,但潜在的分子调控机制尚不清楚。

蛋白质组学(proteomics)技术是将蛋白质组作为研究对象,在疾病的早期诊断,预后和监测疾病的发展中起到至关重要的作用[11]。蛋白质作为生物学功能的效应物,其水平不仅取决于相应的mRNA水平,而且还取决于宿主的翻译控制和调控。因此,蛋白质组学被当作解释生物系统的最有力的数据集[12]。串联质谱标记(tandem mass tags,TMT)的分析方法已经成为蛋白质定量的主流方法[13]。TMT是一种化学标记,可用于定量和鉴定蛋白质、肽、核酸和其他生物大分子[14]。TMT的化学结构虽然相同,但每个都包含在不同区域被取代的同位素。在片段化过程中获得了生物分子序列信息,同时获得了生物分子的数量,这使得TMT成为高通量表征外泌体蛋白的理想工具[15]。蛋白质组学现已成为研究整体蛋白质功能和信号通路的最重要方法之一[16]。近年来,蛋白质组学已被广泛用于猪、奶牛、海洋动物以及肉鸡的研究,也被用于评估牲畜适应热应激的能力[17]。因此,本试验旨在利用蛋白组学技术筛选与热应激相关的肝脏分子标记物,进而为在蛋白质水平上解释姜黄素对蛋鸡热应激的缓解作用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试验设计

试验动物由江苏省南京市南京盘滁机械化养鸡场提供。选取180只280日龄体况基本一致的海兰蛋鸡随机分成3组,每组4个重复,每个重复15只鸡。对照组(Con)饲喂基础饲粮,环境温度为(24±2)℃;热应激组(HS)是基于对照组的基础上每天维持热应激6 h以上,平均温度为(34±2)℃;姜黄素组(HS+CUR)饲喂在基础饲粮中添加姜黄素的试验饲粮,环境温度同热应激组。

试验蛋鸡均保证自由采食和饮水,恒定光照时间为16 h,自然通风,每隔2 d清粪1次。参考本实验室之前的研究,姜黄素的合适剂量为150 mg·kg-1[18]。

1.2 试验方法

1.2.1 TMT标记从3组蛋鸡中随机选取9个样本用于蛋白组学测定,称取150 mg肝脏组织样品,采用蛋白裂解试剂盒提取蛋白质并采用BCA试剂盒测定浓度。按蛋白、酶的质量比为20∶1加入胰酶,在 37 ℃环境温度下酶解4 h。胰酶酶解的肽段用Strata X C18(Phenomenex)除盐后真空冷冻干燥,以 0.5 mol·L-1TEAB溶解肽段,之后按照试剂盒说明书对肽段进行TMT标记,简单操作如下：标记试剂解冻后用乙腈溶解,与肽段混合后室温孵育2 h,标记后的肽段混合后除盐,真空冷冻干燥。将标记过的各组肽段混合,进行HPLC分级肽段,对每组样品进行液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)分析,LC-MS/MS的具体流程参考Biancotto等[19]的方法。二级质谱数据使用 Maxquant v1.5.2.8进行检索,数据库为Gallus gallus(共30 252条序列)。利用 InterProScan v.5.14-53.0对鉴定到的差异蛋白进行 GO 注释,包括3个方面：生物学过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF);利用KEGG Mapper V2.5软件对差异蛋白进行KEGG通路注释;通过Wolfpsort v.0.2来分析差异蛋白亚细胞定位;利用Perl module v.1.31进行差异蛋白的功能富集分析[20-21]。

1.2.2 实时荧光定量PCR分析用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取肝脏组织总RNA。使用PrimeScriptTMRT Master Mix Reagent试剂盒(TaKaRa,大连),通过逆转录合成cDNA。查阅NCBI数据库,根据GenBank中收录鸡的相关基因mRNA序列,用Primer 5.0软件设计引物,引物序列见表1。实验结果剔除非正常值后取3个重复的平均CT值,通过内参基因β-actin校正后,用2-ΔΔCT法分析基因表达情况。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences of the target genes

1.3 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 姜黄素对热应激蛋鸡肝脏抗氧化基因表达的影响

由图1可见,热应激极显著抑制蛋鸡肝脏中SOD1和GPX1的表达(P<0.01),显著抑制CAT表达(P<0.05),而热应激状态下补充姜黄素后蛋鸡肝脏中SOD1和CAT表达水平与热应激组相比分别增加35.66%(P<0.01)和79.54%(P<0.05),GPX1表达水平是热应激组的14.26倍(P<0.01)。结果表明热应激诱导蛋鸡肝脏抗氧化功能降低,而添加姜黄素可以缓解这一现象。

图1 姜黄素对热应激蛋鸡肝脏 抗氧化基因表达的影响Fig.1 The effect of curcumin on the expression of antioxidant genes in the liver of heat-stressed laying hens Con：对照组Control group;HS：热应激组Heat stress group;HS+CUR：姜黄素组Curcumin group. *P<0.05,**P<0.01. 下同The same as follows.

2.2 蛋鸡肝脏蛋白鉴定的结果分析

采用TMT蛋白组学分析技术测定了蛋鸡肝脏的蛋白质图谱,通过质谱分析共得到313 208张二级谱图,可利用有效谱图数为66 217,谱图利用率为21.1%。通过谱图解析共鉴定到36 789条肽段,其中特异性肽段为 34 549。共检测到5 039个蛋白,其中4 235个具有定量信息。为了更加深入揭示不同组肝脏的蛋白差异,分别定量比较了差异蛋白表达量,结果见表2。

表2 差异表达蛋白统计信息Table 2 Differentially expressed protein statistics

2.3 不同组别比较的GO二级分析

从图2可知：在HS+CUR vs Con和HS+CUR vs HS中,差异表达蛋白参与的生物学过程(BP)主要有代谢过程(metabolic process)、单一生物过程(single-organism process)和细胞进程(cellular process)等GO条目;DEG在细胞组分(CC)中主要有细胞(cell)、细胞器(organelle)、膜(membrane)、大分子复合物(macromolecular complex)等GO条目;在分子功能(MF)中主要是催化活性(catalytic activity)和结合(binding)等GO条目。

图2 GO二级注释的分布图Fig.2 Statistical distribution chart of GO category(2nd level)A. HS+CUR group vs Con group;B. HS+CUR group vs HS group.

2.4 不同组别比较的KEGG通路富集分析

对差异表达蛋白进行KEGG 通路富集分析(图3)发现：HS+CUR组和Con组比较过氧化物酶体(peroxisome)、PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)、脂肪细胞因子信号通路(adipocytokine signaling pathway)、药物代谢-细胞色素P450(drug metabolism-cytochrome P450)、甘油磷脂代谢(glycerophospholipid metabolism)、酪氨酸代谢(tyrosine metabolism)等通路被显著富集(P<0.05);HS+CUR组和HS组比较氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、药物代谢-其他酶(drug metabolism-other enzymes)、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(glycine,serine and threonine metabolism)、细胞黏附分子(CAM)、药物代谢-细胞色素P450(drug metabolism-cytochrome P450)、PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)等通路被极显著富集(P<0.01)。

图3 差异表达蛋白在KEGG通路中富集分布气泡图Fig.3 KEGG pathway enrichment bubble plot of differentially expressed proteinsA. HS+CUR group vs Con group;B. HS+CUR group vs HS group.

2.5 差异显著蛋白表达及其mRNA表达的比较分析

生物体中的基因组是遗传信息的存储,mRNA是基因表达的前提,蛋白质水平是基因功能的执行者。根据差异表达蛋白亚细胞不同的定位,选择分布在细胞核、细胞质和细胞外的15种差异显著表达蛋白质进行RT-qPCR分析,以验证蛋白组结果的可靠性。结果如表3和图4所示,15种蛋白质在基因水平上具有与蛋白组结果中相似的变化趋势。

图4 肝脏中基于TMT蛋白组学筛选的不同亚细胞定位差异表达显著蛋白相关基因mRNA水平的表达变化Fig.4 Different sub-cellular positioning differences based on the TMT protein group expressed significant protein-related genes in the liver mRNA level in the liver A. 细胞核Nucleus;B. 细胞质Cytoplasm;C. 细胞外Extracellular. 将对照组中的数据设置为1.0,得到的数值是每组的

表3 蛋白组学分析挑选的差异表达显著蛋白Table 3 Differential expression significant protein selected by proteome

3 讨论与结论

动物拥有针对热应激的生理机制,以保护不同细胞的功能。各器官对这种与热应激相关损伤的反应和敏感度不同,而肝脏作为主要的代谢和产热器官,是热应激的主要靶器官,可控制长时间受热应激影响的许多生理过程。研究已经证实热应激可能诱发肝损伤[22]。在热应激条件下,已经证明肝脏组织超微结构发生改变,肝细胞部分变性,坏死并伴有凋亡增加[23]。但目前尚不清楚热应激如何在蛋白质水平上影响肝脏各种生理过程。在本研究中,我们发现与对照组相比,热应激组蛋鸡肝脏抗氧化指标SOD1、CAT和GPX1 mRNA的表达水平显著降低,意味着(34±2)℃温度下蛋鸡发生了热应激。姜黄素作为一种植物提取物,具有抗氧化、抗炎、抑制脂质过氧化等作用。在我们的研究中发现添加姜黄素显著增加由热应激引起的SOD1、CAT和GPX1的降低水平。据报道,姜黄素可以通过减少ROS的产生和脂质过氧化来维持线粒体功能,防止超氧化物歧化酶2(SOD2)和谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)的活性降低[24]。也有研究证明,姜黄素可以逆转受热应激的抗氧化活性表达的下调[25],这与本研究得到的结果一致。因此,姜黄素可以有效抑制由高温引起的蛋鸡热应激。

为了进一步在蛋白水平上研究姜黄素对蛋鸡热应激缓解作用的分子机制,我们利用TMT蛋白组学技术在蛋鸡肝脏组织中筛选得到与热应激相关的差异表达蛋白,并进一步进行生物信息学分析。本研究挑选了不同亚细胞定位的15个表达显著的差异蛋白进行RT-qPCR验证,得到的基因水平结果与蛋白组学分析结果保持一致,证明蛋白组学结果的可靠性。

KEGG通路富集分析结果提示差异表达蛋白参与了PPAR信号通路和过氧化物酶体,过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1家族的3个主要成员(PPARGC-1α,PPARGC-1β和PRC),其在能量代谢调节、维持葡萄糖稳态和脂质代谢中发挥着关键作用,PPARGC-1β作为其成员的重要组成部分,是线粒体氧化能量代谢和抗氧化防御的主要调控因子[26]。研究发现其与多种生物学过程相关并且参与多种疾病的发生,诸如肝脂肪变性、糖尿病和心肌病等。PPARGC-1β基因是一种调控基因转录的共激活剂,对转录因子和核受体活动、脂肪氧化、糖酵解以及能量代谢等多种生物学过程具有调控作用[27]。本研究结果表明热应激状态下的蛋鸡肝脏PPARGC-1β表达显著降低,添加姜黄素可以促进PPARGC-1β的表达。

HSP通过调节细胞稳态并促进细胞存活而充当分子伴侣,HSP40(DnaJ)是HSP70在调节ATP水解中的伴侣[28]。本研究中,DnaJB1和HSP70蛋白差异表达水平显著升高,补充姜黄素后DnaJB1和HSP70的表达水平与热应激组相比显著减少。检测肝脏mRNA表达的结果显示DnaJB1和HSP70的变化趋势一致,DnaJB1的表达对HSP70具有依赖性。据报道,HSP70蛋白通过肝脏线粒体途径增加,最终导致细胞凋亡[29]。本研究结果显示热应激组蛋鸡肝脏的HSP70表达水平与对照组和姜黄素组相比均显著升高,这与da Silva等[30]研究结果一致。本研究结果表明添加姜黄素可以调节HSP相关蛋白的表达,但其作用机制还有待进一步研究。

MAPK在信号传导的信号程序中起多种功能作用,导致特定细胞类型的增殖、运动、温度变化和存活以及各种生理过程[31]。有研究表明MAPK可以在热应激下维持细胞的氧化还原稳态[32]。本研究差异蛋白分析结果显示,姜黄素组与对照组和热应激组相比,核因子κB激酶亚基β(IKBKB)的表达在饲喂姜黄素后显著增加,其参与NF-κB和MAPK信号通路调节。参与MAPK信号通路调节的相关蛋白还包括Nik相关激酶(NRK),其表达水平与其他2组比较在姜黄素组显著升高。这些结果都提示姜黄素缓解蛋鸡肝脏氧化应激可能是通过参与MAPK和NF-κB信号通路来实现的。

脂质代谢是肝脏最重要的代谢过程之一,正常的脂质代谢与机体健康密切相关。肝脏中脂质代谢的失调可使肝脂肪变性,导致慢性脂肪性肝炎[33]。本研究结果表明,热应激组与对照组相比载脂蛋白A-1(APOA1)表达水平显著升高,饲喂姜黄素能缓解热应激状态下蛋鸡肝脏载脂蛋白A-1的表达下调。载脂蛋白A-1是高密度脂蛋白的主要结构和功能蛋白成分,主要由肝细胞在肝脏中产生[34]。本研究证明了饲喂姜黄素可以有效保护热应激对蛋鸡肝脏脂质代谢的影响。

综上,姜黄素可改变蛋鸡肝脏热应激和氧化应激相关蛋白的表达,本研究相关结果可为探索夏季蛋鸡肝脏热应激机制提供试验基础,下一步研究中可通过检测蛋鸡肝脏中上述几种蛋白的表达水平变化,进一步敲除编码这些蛋白的基因,以验证其在热应激及氧化应激过程中发挥的具体作用。