饲粮添加不同水平芦丁对肉鸡肉品质和抗氧化功能的影响

马龙飞,陈顺,周斌斌,刘慧娟,张佳琦,王恬,王超

(南京农业大学动物科技学院,江苏 南京210095)

肉鸡产品具有较高的营养价值及相对低廉的价格,现已成为居民肉类食品中不可缺少的部分。随着生活水平的日益提高,消费者对肉鸡的肉品质也有了更高要求。研究发现,过量的氧自由基可与鸡肉中大量蛋白质、脂质特别是不饱和脂肪酸(UFA)发生氧化反应,降低鸡肉风味,严重影响肉品质[1]。此外,肉的保水性、色泽和嫩度也会影响肉品质,影响消费者的购买欲望。营养调控是一种有效改善鸡肉品质的方式。近年来,在饲粮添加具有绿色、多功能等特点的植物提取物以提高机体抗氧化功能、改善鸡肉品质的营养调控方式受到广泛关注[2]。

芦丁(rutin)又名芸香苷,是一种多酚类化合物,化学式为C27H30O16,可从白纹豆属、菖蒲属、桉树属等植物中获得[3-4]。芦丁对超氧化物、过氧化物及自由基等表现出较高的抗氧化性质,具有广泛应用于医药、饲料等行业的潜力[5],同样芦丁还具有抗菌[6]、抗炎[7]、预防肥胖[8]和维护肠道功能[9]等作用。研究发现,芦丁可减少高脂饮食诱导小鼠肌肉中脂肪含量[10];还可显著改善银鲶鱼肌肉中的脂肪酸分布,进而防止肌肉损伤[11];还有研究发现饲粮添加0.15%芦丁可缓解嗜水藻诱导的银鲶鱼氧化应激,提高抗氧化能力[12]。芦丁在畜禽生产中也有广泛应用,Hassan等[13]研究发现,在肉仔鸡饲粮中添加1 000 mg·kg-1芦丁可显著增强肉仔鸡肝脏抗氧化能力,提高生长性能;芦丁可增强奶牛抗应激能力,提高其生产性能[14];王海波等[15]也发现芦丁可提高湖羊机体抗氧化能力。目前,关于芦丁的研究主要集中在小鼠、鱼类及反刍动物上,饲粮中添加芦丁对肉鸡肉品质的影响研究尚未见报道。因此,本试验通过在饲粮中添加不同水平的芦丁,从肉鸡肌肉品质、脂肪酸含量、抗氧化能力等系统评估芦丁对肉鸡肉品质的影响,为芦丁在肉鸡上的应用及研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

选择256只1日龄AA肉鸡[(43±0.5)g]为试验对象,将其随机分为4组,每组8个重复,每个重复 8只鸡,分别饲喂基础饲粮添加0 mg·kg-1(对照组),以及250、500和1 000 mg·kg-1芦丁(处理组)。试验期 42 d,分为饲养前期(1～21 d)和饲养后期(22～42 d)。基础饲粮按照美国国家研究委员会颁布的家禽营养需求标准(NRC,1994)配制,相应成分和营养水平见表1。试验所用芦丁(纯度>95%)购自上海阿拉丁生物技术股份有限公司。

表1 基础饲粮原料组成及营养组成Table 1 Ingredient compositions and nutrient compositions of basal diets %

1.2 饲养管理

禽舍消毒1周后采用3层叠笼饲养,每笼8只肉鸡,各组间各重复的肉鸡在同层高的笼子里进行饲养,避免层高对其产生的影响。试验期间,肉鸡自由采食粉料和饮水,前3 d房间温度保持恒温(34±1)℃,每周稳定下降2～3 ℃,最终温度为22 ℃,相对湿度45%～55%,按常规程序进行免疫。

1.3 样品采集与处理

在试验第42天时,试验鸡禁食12 h后,每重复选取接近该重复平均体重的1只鸡屠宰,解剖取左侧胸肌样品,用于抗氧化酶活和相关基因表达的分析,右侧胸肌样品用于肉品质、低场核磁共振技术(NMR)、脂肪酸等相关指标测定。

1.4 指标测定与方法

1.4.1 胸肌肉品质取右侧胸肌使用色度计(Konica Minolta Sensing Inc,日本)测定肌肉肉色(亮度、红度、黄度),使用便携式pH计(HI9125,HANNA Instruments,意大利)测定肌肉pH值(pH45 min、pH24 h),使用数字嫩度仪(C-LM3B,东北农业大学)测定肌肉剪切力,使用电子天平等仪器测定肌肉蒸煮损失和滴水损失(24和48 h)等指标,具体操作步骤参照王雨雨等[16]的方法。

1.4.2 胸肌水分状态及分布情况称取胸肌样品(约2 g)使用PQ001 LF-NMR分析仪(上海纽迈电子科技有限公司)测定肉鸡胸肌中结合水、不易流动水、自由水的弛豫时间(T2b、T21、T22)并计算得出相应峰面积比(P2b、P21、P22)。具体操作步骤参照黄子信等[17]的方法。

1.4.3 脂肪酸组成分析脂肪酸组成测定采用气相色谱法,称取2 g左右胸肌样品到试管中,用氯仿-甲醇法提取肌肉中的脂质,加2 mL十五碳酸(5 mg·mL-1)、2 mL氯仿-甲醇(2∶1)、1 mL 8.3 mol·L-1盐酸,混匀。在水解(70～80 ℃,40 min)期间,每10 min振荡试管1次。水解完成后取出试管冷却至室温。然后用氢氧化钠/甲醇对脂肪酸甲酯进行气相色谱预处理后上气相色谱仪(Agilent Technologies Co,Ltd,Palo Alto,CA)检测,具体步骤参照Yu等[18]的方法。

1.4.4 胸肌组织抗氧化酶活性测定取胸肌组织样品(约100 mg)与生理盐水按质量体积比为1∶9的比例匀浆,在4 ℃、3 000 r·min-1离心15 min,吸取上清液用于测定胸肌组织中总蛋白(total protein,TP)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和总抗氧化能力(total anti-oxidant capacity,T-AOC)、总超氧化物歧化酶(total-superoxide dismutase,T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性。试剂盒均购自南京建成生物研究所,测定步骤按照试剂盒说明书进行。

1.4.5 胸肌组织mRNA相对表达量测定取胸肌组织样品(约0.1 g),使用TRIzol试剂(TaKaRa)提取总RNA,通过RT-qPCR检测目的基因mRNA表达量。具体操作根据刘慧娟等[19]的研究方法。以β-actin为内参基因,使用2-ΔΔCT方法计算各基因mRNA的相对表达量[20]。引物序列见表2。

表2 本试验中PCR引物序列Table 2 PCR primers sequences in this experiment

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 22.0统计软件对试验数据进行单因素方差分析,并用Duncan’] s法进行多重比较,采用多项式中的线性和二次分析对芦丁不同梯度的效果进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同水平芦丁对肉鸡肌肉品质的影响

如表3所示：与对照组相比,饲粮中添加250、500和1 000 mg·kg-1芦丁显著降低了胸肌宰后24和 48 h 的滴水损失(PT<0.05),且肉鸡胸肌宰后24和48 h的滴水损失与芦丁添加量有显著剂量效应(PL<0.05;PQ<0.05);添加250与500 mg·kg-1芦丁分别降低了胸肌的蒸煮损失与剪切力值(PT<0.05),且胸肌蒸煮损失和剪切力值与芦丁添加量呈二次曲线相关(PQ<0.05);添加500和1 000 mg·kg-1芦丁显著提高了胸肌pH24 h值(PT<0.05),且随着芦丁添加量的增加,胸肌pH24 h值呈线性增加(PL<0.05)。但饲粮添加250、500和1 000 mg·kg-1芦丁对胸肌肉色和pH45 min值未产生显著影响(PT>0.05)。

表3 不同水平芦丁对肉鸡胸肌肉品质的影响Table 3 Effects of different levels of rutin on breast muscle quality of broilers

2.2 不同水平芦丁对肉鸡胸肌水分分布状态的影响

如表4可知：与对照组相比,饲粮中添加500 mg·kg-1芦丁显著降低了肉鸡胸肌中自由水的弛豫时间T22值(PT<0.05);饲粮添加250、500和1 000 mg·kg-1芦丁对肉鸡胸肌中结合水、不易流动水和自由水的峰面积比(P2b、P21和P22)未产生显著影响(PT>0.05)。

表4 不同水平芦丁对肉鸡胸肌水分分布状态的影响Table 4 Effects of different levels of rutin on breast muscle water distribution of broilers

2.3 不同水平芦丁对肉鸡肌肉脂肪酸含量的影响

如表5所示：与对照组相比,饲粮中添加250和500 mg·kg-1芦丁显著增加了肉鸡胸肌中硬脂酸含量(PT<0.05),500 mg·kg-1芦丁组胸肌中棕榈油酸和二十四碳一烯酸含量显著增加(PT<0.05),且胸肌中硬脂酸、棕榈油酸和二十四碳一烯酸含量与芦丁添加量呈二次曲线相关(PQ<0.05);饲粮中添加500和 1 000 mg·kg-1芦丁显著提高了肉鸡胸肌中花生一烯酸和多不饱和脂肪酸(PUFA)含量(P<0.05),1 000 mg·kg-1芦丁组胸肌中γ-亚油酸含量显著降低(PT<0.05);并随着芦丁添加量的增加,胸肌中花生一烯酸、花生四烯酸、多不饱和脂肪酸和γ-亚油酸含量值呈线性增加(PL<0.05),但饲粮添加250、500和1 000 mg·kg-1芦丁对肉鸡胸肌中其他脂肪酸含量未产生显著影响(PT>0.05)。

表5 不同水平芦丁对肉鸡胸肌中脂肪酸含量的影响Table 5 Effects of different levels of rutin on fatty acid content in breast muscle of broilers %

2.4 不同水平芦丁对肉鸡肌肉抗氧化能力的影响

如表6所示：与对照组相比,饲粮中添加500 mg·kg-1芦丁显著降低了胸肌中MDA含量(PT<0.05),提高了T-SOD活性(PT<0.05),胸肌中T-SOD活性和T-AOC与芦丁添加量呈线性增加(PL<0.05),胸肌中MDA含量与芦丁添加量呈二次曲线相关(PQ<0.05),但饲粮添加250、500和1 000 mg·kg-1芦丁对肉鸡胸肌中GSH-Px和CAT活性无显著影响(PT>0.05)。

表6 不同水平芦丁对肉鸡肌肉抗氧化能力的影响Table 6 Effects of different levels of rutin on antioxidant capacity muscle in broilers

2.5 不同水平芦丁对肉鸡肌肉抗氧化相关基因表达量的影响

如图1所示：与对照组相比,饲粮中添加250和500 mg·kg-1芦丁显著提高了胸肌中SODmRNA的表达量(PT<0.05),且SODmRNA的表达量(PQ<0.05)与芦丁添加量呈二次曲线相关(PQ<0.05);饲粮中添加500 mg·kg-1芦丁显著提高了胸肌中Nrf2 mRNA的表达量(PT<0.05),并随着芦丁添加量的增加,胸肌中Nrf2和GSH-PxmRNA的表达量呈线性增加(PL<0.05)。但饲粮添加250、500和1 000 mg·kg-1芦丁对HO-1和NQO1 mRNA的表达量无显著影响(PT>0.05)。

图1 不同水平芦丁对肉鸡肌肉抗氧化相关基因mRNA表达量的影响Fig.1 Effects of different levels of rutin on mRNA expression of antioxidant-related genes in broiler muscles

3 讨论

3.1 不同水平芦丁对肉鸡肌肉品质和水分分布的影响

肉色、pH、滴水损失、蒸煮损失、系水力及嫩度等是反映肉品质的主要指标[21]。肌肉pH值反映了其酸碱度,其可直接影响肌肉的肉色和剪切力等,动物屠宰后糖酵解反应产生乳酸,其可降低肌肉pH值,导致肌肉风味变差,保水性下降,进而影响肌肉品质[22]。本试验中,添加500和1 000 mg·kg-1芦丁显著提高了肉鸡胸肌pH24 h值,此结果表明芦丁能够提高肉鸡胸肌pH值并改善肌肉品质。肌肉肉色可反映肌肉的生理和生化等水平,是评价肉品质的重要指标之一[23]。郑旭[24]研究表明,饲粮添加10和50 mg·kg-1槲皮万寿菊素可显著降低肉鸡胸肌黄度值。在本试验中,饲粮中添加芦丁对肉鸡肌肉肉色的相关指标并无显著影响,这可能与芦丁的纯度和添加剂量不同有关。肌肉滴水损失和蒸煮损失的提高对肉的外观、保水性、食用质量等造成不良影响[25]。肌肉剪切力值可用来评价肌肉的嫩度,剪切力值低则肉质嫩度高,肉质适口性好[26]。在本试验中,饲粮中添加芦丁能够显著降低胸肌屠宰后24和48 h的滴水损失,这与Ouyang等[27]研究发现苜蓿黄酮可降低肉鸡胸肌滴水损失的试验结果相似。添加250 mg·kg-1芦丁显著降低了胸肌蒸煮损失,而添加500 mg·kg-1芦丁显著降低了胸肌剪切力,姜义宝等[28]研究表明,饲粮添加红车轴草异黄酮能够降低肉鸡肌肉中滴水损失和剪切力值,本试验结果与之类似。综上,芦丁可通过提高肉鸡胸肌pH24 h值,降低滴水损失、蒸煮损失和剪切力值,增强鸡肉保水性和嫩度。

肌肉组织中的水分主要包括结合水、不易流动水和自由水。结合水与细胞内部的蛋白质紧密结合,不影响肌肉保水性;不易流动水存在于细胞内部,其含量增加表明肌肉保水性提高;自由水存在于肌肉细胞间隙,为容易流失的不稳定水[29]。弛豫时间(T22)值可反映不易流动水的自由程度,其值越高,不易流动水越容易转变为自由水,导致水分流失增加,保水性能下降[30]。吴烨等[31]研究结果表明,不易流动水和自由水的弛豫时间(T21)和(T22)随着肌肉pH值升高而降低,而本试验结果表明,饲粮中添加500 mg·kg-1芦丁能够显著降低胸肌中自由水弛豫时间(T22)值,这与芦丁可提高胸肌pH24 h值结果相符。综合胸肌滴水损失来看,饲粮添加芦丁可以提高肉鸡肌肉的保水性。

3.2 不同水平芦丁对肉鸡肌肉脂肪酸含量的影响

肌肉不同脂肪酸含量对肉的嫩度、风味和营养价值等均会产生影响,是评价肉品质的重要指标[32]。本试验结果表明饲粮中添加500 mg·kg-1芦丁显著增加了肉鸡胸肌中硬脂酸、棕榈油酸和二十四碳一烯酸的含量。棕榈油酸等不饱和脂肪酸(UFA)在加热过程中氧化产生香气,而硬脂酸也是肌肉中主要的风味前体物质之一,其含量越高,肉质风味越好[33]。因此,本试验结果提示添加芦丁可通过提高肌肉中多种不饱和脂肪酸及硬脂酸含量,增加鸡肉风味。SFA含量过高会引起胆固醇沉积等心血管疾病,而PUFA含量提高不仅可增加肉质风味,还具有调节脂质代谢、缓解炎症反应,预防痴呆症和多种心血管疾病的作用,因此,SFA和PUFA常用来评估肌肉的营养价值[34-36]。本试验结果表明,饲粮中添加500和1 000 mg·kg-1芦丁显著提高了肉鸡胸肌中PUFA含量,但对肉鸡胸肌中SFA含量没有显著影响。因此,芦丁可通过改变肌肉中脂肪酸的含量,进而改善肌肉的营养价值。其原因可能是芦丁中的酚羟基释放的氢与过氧化物结合,通过阻止PUFA氧化,降低肌肉中脂肪酸的氧化程度[37]。

3.3 不同水平芦丁对肉鸡肌肉抗氧化功能的影响

氧化应激会对鸡肉的风味、肉色和营养价值造成不良影响,导致肉品质下降[38]。我们通过对胸肌抗氧化能力研究发现,饲粮中添加500 mg·kg-1芦丁显著降低了胸肌中MDA含量,提高了T-SOD活性。脂质氧化是肌肉氧化的方式之一,MDA是脂质过氧化的重要产物,SOD可通过转化高活性自由基超氧化物,减弱肌肉氧化作用[39-41]。本研究中,500 mg·kg-1芦丁可通过降低MDA含量与提高T-SOD活性来减少脂质过氧化,提高肌肉的抗氧化能力。此外,饲粮中添加500 mg·kg-1芦丁还显著提高了胸肌中Nrf2和SODmRNA的表达量。Nrf2可通过调节相关抗氧化基因表达来增强机体的抗氧化能力[42],这与Tian等[43]在试验中发现腹腔注射芦丁可以增强大鼠抗氧化防御系统的结果一致;Shi等[44]研究也表明饲粮中添加黄酮类化合物芩黄素可通过激活小鼠肝脏中Nrf2 mRNA的表达量,提高机体抗氧化能力。而SODmRNA的表达量的提高与T-SOD活性增强的结果一致。肌肉抗氧化能力的提高可以通过抑制细胞膜上不饱和脂肪酸的过氧化作用,防止产生的自由基与细胞膜上的蛋白质结合引起膜结构改变,使细胞膜通透性增强,从而起到保水的作用[45]。肌肉抗氧化能力的提高也可通过提高肌红蛋白稳定性,改善肌肉色泽[46],与本研究中芦丁可提高PUFA含量和改善肉品质的结果一致。芦丁对肌肉抗氧化功能的改善作用一方面是芦丁作为多酚类物质,本身具有抗氧化作用[47];另一方面是芦丁通过激活Nrf2信号通路,上调相关抗氧化酶基因的表达,提高肌肉抗氧化能力[48]。

综上所述,饲粮添加芦丁可通过激活Nrf2信号通路中相关基因的表达提高肉鸡肌肉抗氧化能力,而肌肉肉品质的提高与脂肪酸组成的变化与芦丁提高肌肉抗氧化能力有关。在本试验条件下,芦丁的适宜添加量为500 mg·kg-1。因此,芦丁可改善肉鸡肌肉品质的作用在畜禽生产方面具有较高的应用前景。