CircRTN4调节miR-224-5p/MYT1L轴对胶质母细胞瘤细胞恶性生物学行为的影响

刘应刚, 李维民, 龙 勇, 向城卫, 张施远, 陈星宇

(四川省遂宁市中心医院, 四川 遂宁 629018)

神经胶质瘤仍然是全球最常见的原发性脑恶性肿瘤,胶质母细胞瘤(GM)是胶质瘤中恶性程度最高的病理类型,尽管治疗方法有所进步,但患者的预后仍然很差。因此,探索GM的发病机制,寻找新的治疗靶点和治疗方法意义重大[1]。环状RNAs(circRNAs)大部分由外显子通过头尾连接产生,在胶质瘤的发展过程中可通过微小RNA(miRNAs)调节基因表达[2]。CircRTN4也称hsa_circ_0001006,在许多癌症中异位表达,如胃癌、胰腺癌等,但其在GM中研究甚少[3]。生物信息学发现miR-224-5p分别与CircRTN4、髓磷脂转录因子1样(MYT1L)存在结合位点,沉默MYT1L表达或上调miR-224-5p显著降低神经胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[4-5]。但CircRTN4能否通过miR-224-5p/MYT1L轴影响GM细胞恶性生物学行为尚未报道。本研究旨在探索CircRTN4对GM细胞恶性生物学行为影响及相关作用机制的研究。

1 材料与方法

1.1细胞来源和培养：中国科学院提供人GM细胞系U118、U87、U251和LN229以及正常人星形胶质细胞细胞系NHA;然后在含有100 U/mL青霉素、10%胎牛血清和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中培养上述细胞,并在37℃下、5% CO2中孵育,当细胞融合达到70-90%时,使用0.25%胰蛋白酶消化并进行传代。

1.2主要试剂与仪器：RPMI-1640培养基、胎牛血清(赛默飞世尔科技公司);青霉素、链霉素(Hyclone);RNAiso Plus试剂(Takara公司);逆转录酶试剂盒(Takara公司);沉默circRTN4 shRNA(sh circRTN4)序列及阴性对照(sh NC)、miR-224-5p抑制剂(miR-224-5p inhibitor)及抑制剂阴性对照(inhibitor NC)、miR-224-5p过表达(miR-224-5p mimics)及过表达阴性对照(mimics NC)(上海基因制药有限公司);CCK-8试剂(天根生物技术有限公司);膜联蛋白V-FITC凋亡试剂盒(BD Biosciences公司);Transwell室(Millipore公司);增殖蛋白(ki-67)、凋亡蛋白(cleaved Caspase-3)、MYT1L一抗(Abcam公司);转膜仪、凝胶成像分析仪、iMark酶标仪(Bio-Rad公司);FACSVia流式细胞仪(美国BD公司);7300荧光定量PCR仪(美国ABI公司);光学显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)。

1.3方 法

1.3.1qRT-PCR检测GM细胞系及NHA细胞中CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA表达水平：从人GM细胞系U118、U87、U251和LN229细胞及NHA细胞中采用RNAiso Plus试剂提取总RNA,随后用逆转录酶试剂盒将总RNA逆转录成cDNA。SYBR Green Master Mix用作荧光指示剂,扩增反应在ABI7300系统上进行。以GAPDH和U6作为本研究中的内源对照。以2-△△Ct计算CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA相对基因表达。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2细胞分组及处理：取对数生长期的U251进行如下分组处理：空白组、sh NC组、sh circRTN4组、sh circRTN4+inhibitor NC组、sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor组;其中空白组不做处理,sh NC组、sh circRTN4组、sh circRTN4+inhibitor NC组、sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor组分别使用Lipofectamine 3000转染试剂盒转染或共转染上述质粒和小RNA至U251细胞,转染48h后进行指标分析。

1.3.3CCK-8法检测细胞增殖：收集细胞并将浓度调节至2×103细胞/孔并接种至96孔板中,然后按照上述分组将细胞在培养箱中孵育0、24、48h,向每孔中加入10 μL CCK-8,并在37℃下保持2h。然后使用酶标仪检测每个孔在450nm处的吸光度(A)值。

1.3.4qRT-PCR检测各组U251细胞中CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA表达水平：操作步骤同1.3.1。

1.3.5流式细胞术检测细胞凋亡：将各组U251细胞接种在6孔板中,然后在室温下以1000×g离心3min,收集U251细胞(1×105)用冷PBS冲洗两次,以1×结合缓冲液重新悬浮细胞,然后加入5 μL异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V和5 μL PI,于25℃黑暗中孵育20min,最后通过流式细胞仪检测细胞凋亡,FlowJo v10软件用于细胞凋亡分析。

1.3.6Transwell实验检测细胞迁移、侵袭：细胞侵入实验：预先涂覆Matrigel并在4℃预冷却过夜,然后200 μL U251细胞悬液(细胞重悬于无血清培养基中,1×105细胞/mL)加入到上室中,并600 μL 10% FBS的培养基加入到下室中。在37℃的细胞培养箱中培养24h,然后移去上室,用4%多聚甲醛固定细胞,并用0.1%结晶紫溶液染色,PBS冲洗细胞3次后,于光学显微镜下随机选择五个视野分析细胞侵入。但对于迁移分析,不使用Matrigel,其他步骤同侵入实验。

1.3.7验证miR-224-5p分别与CircRTN4、MYT1L的靶向关系：将含有特定的野生型(WT)或突变型(MUT)miR-224-5p结合位点的CircRTN4或MYT1L 3’UTR序列克隆到荧光素酶载体中,以构建CircRTN4-WT、MYT1L-WT或CircRTN4-MUT、MYT1L-MUT载体。将上述载体与miR-224-5p mimics及mimics NC共转染至U251细胞,48h后收获细胞,使用双荧光素酶报告试剂盒测量荧光素酶活性。

1.3.8Western blot检测cleaved Caspase-3、ki-67、MYT1L蛋白表达水平：将各组U251细胞用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取总蛋白,然后高速离心20min(13000 r/min,4℃),离心后收集上清液,BCA蛋白检测试剂盒进行浓度定量。将蛋白质样品在100℃煮沸并变性5min,将蛋白质在10% SDS-PAGE上分离并转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭1h后,随后加入稀释的第一抗体(cleaved Caspase-3、ki-67、MYT1L),并将膜在4℃孵育过夜,然后与结合HRP的第二抗体相互作用2h,软件分析目的蛋白表达。

1.3.9动物体内实验：将6周龄的BALB/c裸鼠(厦门大学,许可证号：SCXK(闽)2018-0003)随机分为敲除CircRTN4(sh CircRTN4)组、阴性对照(sh NC)组、空白组,每组10只裸鼠。分别将转染的sh CircRTN4或sh NC U251细胞(3×106细胞)皮下注射到裸鼠中,注射后30d,对裸鼠实施安乐死,并切除肿瘤、称重。

2 结 果

2.1GM细胞系及NHA细胞中CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA表达水平：与NHA细胞相比,U118、U87、U251和LN229细胞中CircRTN4、MYT1L mRNA表达增加,miR-224-5p表达下降(P<0.05),且U251细胞中变化最为显著,故作为后续研究对象,见表2。

表2 CircRTN4 miR-224-5p MYT1L mRNA表达水平比较

2.2各组U251细胞增殖变化：sh circRTN4组24h、48h A450值低于空白组、sh NC组(P<0.05);sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor组24h、48h A450值高于sh circRTN4+inhibitor NC组(P<0.05),见表3。

表3 各组U251细胞A450值的比较

2.3各组U251细胞CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA表达变化：sh circRTN4组CircRTN4、MYT1L mRNA表达低于空白组、sh NC组,但miR-224-5p表达增加(P<0.05);sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor组MYT1L mRNA表达高于sh circRTN4+inhibitor NC组,但miR-224-5p表达下降(P<0.05),CircRTN4表达无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组U251细胞CircRTN4 miR-224-5p MYT1L mRNA表达水平比较

2.4各组U251细胞凋亡变化：sh circRTN4组凋亡率高于空白组、sh NC组(P<0.05);sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor组凋亡率低于sh circRTN4+inhibitor NC组(P<0.05),见图1、表5。

图1 流式细胞仪检测细胞凋亡

表5 各组U251细胞凋亡率的比较

2.5各组U251细胞迁移、侵袭变化：sh circRTN4组迁移、侵袭数低于空白组、sh NC组(P<0.05);sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor组迁移、侵袭数高于sh circRTN4+inhibitor NC组(P<0.05),见图2、表6。

图2 观察细胞迁移、侵袭变化

表6 各组U251细胞迁移侵袭数的比较

2.6验证miR-224-5p分别与CircRTN4、MYT1L的靶向关系：数据库显示miR-224-5p分别与CircRTN4、MYT1L存在结合位点。如图3、4。miR-224-5p mimics+CircRTN4-WT组荧光素酶活性低于mimics NC+CircRTN4-WT组(P<0.05),见表7。miR-224-5p mimics+MYT1L-WT组荧光素酶活性低于mimics NC+MYT1L-WT组(P<0.05),见表8。

图3 miR-224-5p与CircRTN4的结合位点

图4 miR-224-5p与MYT1L的结合位点

表7 CircRTN4靶向调节

表8 miR-224-5p靶向调节

2.7各组U251细胞cleaved Caspase-3、ki-67、MYT1L蛋白的表达水平：sh circRTN4组ki-67、MYT1L表达低于空白组、sh NC组,但cleaved Caspase-3表达增加(P<0.05);sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor组ki-67、MYT1L表达高于sh circRTN4+inhibitor NC组,但cleaved Caspase-3表达下降(P<0.05)。见图5、表9。

图5 细胞中cleaved Caspase-3、ki-67、MYT1L蛋白表达(Western blot图)

表9 各组细胞中cleaved Caspase-3 ki-67 MYT1L表达的比较

2.8干扰circRTN4对移植瘤裸鼠的影响：干扰circRTN4较对照组、sh NC组肿瘤质量显著降低(P<0.05),见表10。

表10 干扰circRTN4对移植瘤裸鼠肿瘤质量的比较

3 讨 论

GM是中枢神经系统最常见的原发性侵袭性肿瘤之一,但神经胶质瘤的确切病因仍不清楚,近年来靶向治疗可预防恶性肿瘤并提高患者存活率[6]。因此确定GM治疗的潜在分子靶点势在必行。

近来年的研究表明,circRNAs的异常表达与包括神经胶质瘤在内的人类恶性肿瘤的发生和发展有关[7]。研究发现小鼠脑中,circRTN4在表达随着原代神经元的分化而增加,参与调节神经发育[8]。先前研究显示[3],circRTN4被确定为胰腺癌脑转移的潜在治疗靶点和生物标志物。基于此,本研究推测circRTN4在GM中上调,参与GM发展。在多种GM细胞系研究中,circRTN4均显著上调,与多种其他肿瘤研究趋势相吻合,尤其是U251细胞变化最为显著。当沉默circRTN4处理U251细胞后,细胞迁移、侵袭数、24h、48h A450值显著降低,细胞凋亡显著增加,提示沉默circRTN4可抑制U251细胞增殖、侵袭及迁移,促进其凋亡。Western blot结果显示ki-67蛋白表达降低,cleaved Caspase-3表达增加,进一步表明沉默circRTN4可抑制U251细胞恶性行为学发展。

CircRNA可以通过miRNA反应元件吸附miRNA,间接调节基因表达,而miRNA是一种调节mRNA翻译的非编码小RNA转录物,参与调节细胞增殖、细胞凋亡、胚胎发育等多种生物学过程以及肿瘤的发生和发展[9]。研究发现miR-224-5p可抑制甲状腺乳头状癌、黑色素瘤包括GM在内的肿瘤发展[10-12]。本研究发现miR-224-5p在多种GM细胞系表达下调,通过生物信息学分析预测了circRTN4与miR-224-5p的结合位点。双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR证实circRTN4能吸附miR-224-5p并负调控其表达,提示circRTN4可能通过上调miR-224-5p发挥抑制U251细胞恶性行为学发展的作用。同时文章还发现MYT1L是circRTN4-miR-224-5p的下游靶点,在GM细胞系中上调,与先前研究相吻合[13]。沉默circRTN4表达增加miR-224-5p的表达,但减少MYT1L的表达,且MYT1L被鉴定为miR-224-5p的靶标并负调控其表达,提示circRTN4可能通过上调miR-224-5p/MYT1L轴抑制GM细胞恶性生物学行为发展。为进一步验证实验结论,以miR-224-5p inhibitor进行回复验证,结果发现miR-224-5p inhibitor逆转了沉默CircRTN4对U251细胞恶性生物学行为的抑制作用,提示沉默CircRTN4抑制U251细胞恶性生物学行为发展,可能与上调miR-224-5p/MYT1L轴有关。最后文章进行了动物体内实验研究,结果发现沉默CircRTN4可抑制裸鼠移植瘤生长,表明CircRTN4可能成为治疗GM细胞的靶点。

综上所述,沉默CircRTN4调节miR-224-5p/MYT1L轴抑制U251细胞恶性生物学行为,CircRTN4有望成为治疗GM的靶点和生物标志物,但由于实验仅是初步研究,结论仍需进一步验证。