LncRNA PURPL调节miR-342-3p/PIK3R1轴对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

王红梅, 陈思瑞, 杜 红

(四川省绵阳市中心医院肝胆乳腺外科, 四川 绵阳 621000)

肝癌是常见的恶性肿瘤之一,也是癌症死亡率的第二大原因[1]。尽管在预防和治疗肝癌方面做出了巨大努力,但肝癌的发病率和死亡率仍在上升[2]。由于在疾病的早期阶段缺乏特定的体征和症状,当诊断为肝癌时,大约70-80%的患者处于不可切除的阶段,患者预后较差[3]。LncRNA可调节癌细胞恶性行为,如增殖、凋亡抵抗、迁移、侵袭和耐药性[4]。研究发现,沉默LncRNA PURPL可抑制肝癌细胞增殖,阻断细胞周期进程,促进细胞凋亡[5]。我们通过TargetScan网站以及双荧光素酶报告基因实验发现LncRNA PURPL靶向调控微小RNA-342-3p(miR-342-3p)/磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基1(PIK3R1)轴。而miR-342-3p是肝细胞癌中有效的肿瘤抑制因子,可以显著减缓肝肿瘤的发展并提高生存率[6]。下调PIK3R1抑制肝癌细胞增殖并促进细胞凋亡[7]。本研究旨在探究LncRNA PURPL是否可以通过调节miR-342-3p/PIK3R1轴抑制肝癌恶性生物学行为。

1 材料与方法

1.1细胞系及主要试剂：人正常肝细胞系L02、MTT细胞增殖与毒性检测试剂盒购自武汉尚恩生物技术有限公司;人肝癌细胞系Huh-7、小鼠肝癌细胞H22、Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒购自武汉普诺赛生命科技公司;PIK3R1抗体购自Abcam。

1.2方 法

1.2.1细胞分组：将Huh-7细胞分别用si-NC、si-PURPL、inhibitor NC和miR-342-3p inhibitor转染,分为si-NC组、si-PURPL组、si-PURPL+inhibitor NC组、si-PURPL+miR-342-3p inhibitor组;另设置正常培养的Huh-7细胞为NC组。

1.2.2双荧光素酶实验：于Huh-7细胞中分别转染PURPL-WT、PURPL-MUT、PIK3R1-WT、PIK3R1-MUT质粒和mimic NC(或miR-342-3p mimic),48h后检测荧光素酶活性。

1.2.3qRT-PCR检测：提取细胞总RNA并进行反转录。再在Applied Biosystems®7500实时PCR系统上通过qRT-PCR检测LncRNA PURPL、miR-342-3p的表达水平,PCR参数：95℃预变性5min,95℃变性10s,60℃退火10s,72℃延伸20s(40个循环)。LncRNA PURPL、miR-342-3p分别以GAPDH和U6为内参。2-ΔΔCt计算表达水平。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.2.4Western blot检测PIK3R1蛋白表达：将细胞在RIPA裂解液中匀浆,并在4°C下离心30min。使用SDS-PAGE对等量蛋白进行分离,并转膜。将膜封闭1h后,与一抗：PIK3R1(1∶1000)、GAPDH( 1∶1000)孵育24h,在室温下再与二抗孵育1h。ECL显影,Image J软件分析条带灰度值。

1.2.5MTT法检测细胞增殖：首先,将各组Huh-7细胞接种到96孔板中,在每个孔加入20μL的MTT溶液孵育4h,再加入100μL二甲基亚砜,然后使用振荡器轻轻振荡10min。当所有紫色晶体完全溶解时,使用酶标仪测量490nm处的光密度值。

1.2.6流式细胞术检测凋亡：转染24h后收集各组细胞,使用Annexin V-FITC及PI(各5 μL)孵育10min。流式细胞仪分析细胞凋亡。

1.2.7Transwell试验测定细胞侵袭：通过Transwell小室实验测定各组Huh-7细胞的侵袭能力。Matrigel基质胶包被在Transwell上室中。在下腔室中加入含有胎牛血清的培养基,在上腔中加入各组的Huh-7细胞悬浮液,浓度为1×105个/mL。在培养箱中培养24h后,将上腔中残留的Huh-7细胞擦拭干净,然后用多聚甲醛固定并用结晶紫染色。干燥后,在显微镜下观察细胞,并计算侵袭细胞的数量。

1.2.8划痕试验测定细胞迁移：在6孔板中培养转染后的Huh-7细胞24h。用枪头在板底部做垂直划痕。然后,将6孔板在培养箱中再培养24h,计算划痕愈合率。划痕愈合率越高,细胞迁移能力越强。划痕愈合率(%)=(0h划痕宽度-24h划痕宽度)/0h划痕宽度×100%。

1.2.9异种移植肿瘤模型：从湖北省实验动物研究中心(SCXK(鄂)2020—0018)购买6周龄雄性BALB/c裸鼠。将1×105个/mL H22细胞注射到BALB/c裸鼠的右侧腋窝皮下,然后通过尾静脉注射sh-NC、sh-PURPL、sh-PURPL+antiagomir NC、sh-PURPL+miR-342-3p antiagomir,分别记为si-NC组、si-PURPL组、si-PURPL+inhibitor NC组、si-PURPL+miR-342-3p inhibitor组,仅注射Huh-7细胞的裸鼠记为NC组,在注射6周后将裸鼠处死,取出裸鼠肿瘤并称重。肿瘤体积：体积=肿瘤长度×肿瘤宽度2/2。本研究已获得本院动物伦理委员会的批准。

2 结 果

2.1LncRNA PURPL调控miR-342-3p：miR-342-3p与LncRNA PURPL有互补的结合位点(图1)。miR-342-3p mimic+WT-PURPL组细胞荧光素酶活性较miR-NC+WT-PURPL组降低(0.39±0.04比1.07±0.12,t=13.168,P<0.05),miR-342-3p mimic+MUT-PURPL组与miR-NC+MUT-PURPL组荧光素酶活性差异无统计学意义(1.04±0.13比1.05±0.11,t=0.144,P>0.05)。

图1 LncRNA PURPL与miR-342-3p结合位点预测

2.2PIK3R1是miR-342-3p的靶基因：miR-342-3p与PIK3R1有互补的结合位点(图2)。miR-342-3p mimic+WT-PIK3R1组荧光素酶活性较miR-NC+WT-PIK3R1组下降(0.43±0.05比1.09±0.14,t=10.875,P<0.05),miR-342-3p mimic+MUT-PIK3R1组较miR-NC+MUT-PIK3R1组荧光素酶活性无显著差异(1.05±0.13比1.07±0.15,t=0.247,P>0.05)。

图2 PIK3R1与miR-342-3p的结合位点预测

2.3LncRNA PURPL、miR-342-3p、PIK3R1在细胞中的表达：与L02细胞相比,Huh-7细胞中LncRNA PURPL、PIK3R1表达升高,miR-342-3p表达降低(P<0.05),见图3、表2。

图3 Western blot检测细胞中PIK3R1蛋白水平

表2 LncRNA PURPL miR-342-3p PIK3R1蛋白在细胞中的表达

2.4沉默LncRNA PURPL或下调miR-342-3p对PIK3R1蛋白表达的影响：si-PURPL组LncRNA PURPL、PIK3R1表达较si-NC组降低,miR-342-3p表达较si-NC组升高(P<0.05);si-PURPL+miR-342-3p inhibitor组PIK3R1表达较si-PURPL+inhibitor NC组升高,miR-342-3p表达较si-PURPL+inhibitor NC组降低(P<0.05),见图4、表3。

图4 Western blot检测Huh-7细胞PIK3R1蛋白表达

表3 各组细胞中LncRNA PURPL miR-342-3p PIK3R1表达比较

2.5各组细胞活性比较：与si-NC组相比,si-PURPL组细胞活性降低(P<0.05);si-PURPL+miR-342-3p inhibitor组较si-PURPL+inhibitor NC组细胞活性升高(P<0.05),见表4。

表4 各组细胞活性比较

2.6各组细胞凋亡比较：与si-NC组相比,si-PURPL组细胞凋亡率升高(P<0.05);与si-PURPL+inhibitor NC组相比较,si-PURPL+miR-342-3p inhibitor组细胞凋亡率降低(P<0.05),见图5,表5。

图5 流式细胞术检测Huh-7细胞凋亡

表5 各组细胞凋亡率比较

2.7各组细胞侵袭、迁移能力比较：与si-NC组相比,si-PURPL组划痕愈合率、侵袭细胞数减少(P<0.05);与si-PURPL+inhibitor NC组相比,si-PURPL+miR-342-3p inhibitor组划痕愈合率、侵袭细胞数增加(P<0.05),见图6～7、表6。

图6 划痕试验测定检测Huh-7细胞迁移能力

图7 Transwell检测Huh-7细胞侵袭(×400)

表6 各组细胞划痕愈合率和侵袭细胞数比较

2.8沉默LncRNA PURPL或下调miR-342-3p 对肿瘤体积和肿瘤质量的影响：si-PURPL组肿瘤体积和质量较si-NC组下降(P<0.05);si-PURPL+miR-342-3p inhibitor组肿瘤体积和质量较si-PURPL+inhibitor NC组升高(P<0.05),见图8,表7。

图8 各组裸鼠肿瘤代表图

表7 沉默LncRNA PURPL或下调miR-342-3p 对肿瘤体积和肿瘤质量的影响

3 讨 论

LncRNA通过人类转录组测序被鉴定出来。研究揭示其与癌症相关,其中一些在肝癌的发生和进展中起着至关重要的作用[8]。近期发现,敲低LncRNA PURPL诱导细胞凋亡并使肝癌细胞对阿霉素敏感[9]。而在我们实验中,与正常肝细胞系相比,LncRNA PURPL在肝癌细胞系中明显过表达。进一步暗示LncRNA PURPL可能是肝癌的靶基因,沉默LncRNA PURPL可能对肝癌的发展起到抑制作用。已有报道证明LncRNA PURPL的敲低抑制癌细胞增殖,阻断癌细胞周期进程并促进癌细胞凋亡[10]。在本研究中,沉默LncRNA PURPL在体外使Huh-7细胞OD490值、划痕愈合率、侵袭细胞数量显著下降,Huh-7细胞凋亡率显著升高,在体内抑制裸鼠移植瘤的生长。进一步证实敲低PURPL可以抑制Huh-7细胞增殖,促进其凋亡,进而抑制肝癌的进展。

LncRNA可以通过调节相关miRNA的功能影响各种基因的表达。LncRNA-miRNA-mRNA参与不同类型癌症的发生和发展。在线预测发现miR-342-3p是LncRNA PURPL的潜在靶miRNA并证实LncRNA PURPL可调控miR-342-3p表达。以上研究已经证实PURPL在肝癌中的作用,而miR-342-3p已被证实是肝癌复发和预后预测的生物标志物[11]。miR-342-3p抑制肝癌细胞增殖和迁移,并诱导细胞凋亡[12]。而下调miR-342-3p促进了肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,进而促进肝细胞癌进展[13]。在本研究中,miR-342-3p在Huh-7细胞中低表达,沉默LncRNA PURPL可上调miR-342-3p表达,且下调miR-342-3p可减弱沉默LncRNA PURPL对Huh-7细胞的作用。提示沉默LncRNA PURPL抑制Huh-7细胞恶性表型的功能可能与上调miR-342-3p有关。

此外,本研究发现PIK3R1是miR-342-3p的靶基因。PIK3R1可以调节癌细胞增殖,PIK3R1在肝癌组织中高表达,敲低PIK3R1抑制肝癌细胞系的增殖、迁移,并促进细胞凋亡[14]。Liu 等人[15]也发现,下调PIK3R1影响肝癌细胞的索拉非尼的耐药性。本研究发现,PIK3R1在Huh-7细胞中呈高表达,沉默LncRNA PURPL可抑制PIK3R1蛋白水平,而下调miR-342-3p后PIK3R1表达升高,提示沉默LncRNA PURPL对Huh-7细胞恶性表型的抑制作用可能与调控miR-342-3p/PIK3R1轴有关。

综上,沉默LncRNA PURPL可抑制Huh-7细胞恶性表型,其功能可能与调控miR-342-3p/PIK3R1轴有关。本研究体内研究较浅,我们下步将在小鼠上深入研究。