江西省耐多药结核分枝杆菌链霉素基因突变特征

于圣铭 夏良华 詹佳欢 刘思琦 王伟 晏亮 陈开森，4

1南昌大学第一附属医院高新医院（南昌 330096）；2南昌大学公共卫生学院（南昌 330019）；3江西省胸科医院（南昌 330006）；4南昌市肿瘤基因诊断与创新治疗研究重点实验室（南昌 330038）

据《全球2022年结核病报告》报道，2021年结核（tuberculosis，TB）发病人数比2020年上升了3.6%，耐多药结核病（multidrug-resistantM.tuberculosis，MDR-TB）的发病患者数也呈现上升趋势［1］。虽然近年来我国TB 数及MDR-TB 感染人数下降明显［2］，但由于人口基数大及地区发展不平衡，目前感染人数仍处于全球前列，TB 特别是MDR-TB 的防控形势依旧严峻［3］。链霉素（streptomycin，SM）属于氨基糖苷类抗生素，是治疗TB 的一线药物及传统性药物［4，5］，由于SM 杀菌能力强，肌肉注射效果好，也常用于MDR-TB 感染的联合治疗［6］。

氨基糖苷类抗生素作用机制是，直接与核糖体小亚基相互作用，干扰翻译校对，从而导致蛋白质合成的抑制［7］。目前基因组学研究证明，核糖体蛋白S12（rpsL）、16S rRNA（rrs）和7-甲基鸟苷（m7G）甲基转移酶（gidB）与SM 耐药密切相关［8-10］。由于结核菌生长慢，以培养为基础的常规的表型检测技术很难适用MDR-TB 高负担地区及国家，迫切需要被新的技术取代［11］。此外，TB 的流行、耐药特征及进化与菌型具有重要关系［12］。前期研究证实江西省流行的结核菌主要是北京基因型菌，但该型别菌是否与SM 基因突变及表型耐药具有关联未见探讨。本研究收集南昌大学第一附属医院高新医院及江西省胸科医院2021年度临床分离的MDR-TB 菌株，检测菌株是否为北京基因型，同时检测SM 耐药相关的基因，分析菌株耐药是否与TB 型别具有关系，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源菌株来源于南昌大学第一附属医院高新医院及江西省胸科医院，就医患者来源于全省各地。结核分枝杆菌H37Rv 标准株（NC 000962.3）为参考菌株。

1.1.2 主要试剂与仪器MGIT 960 及配套的各类试剂：美国BD 公司；罗氏固体培养基、对硝基苯甲酸（PNB）、噻吩-2-羧基肼（TCH）等购于江西全景生物科技有限公司；高速低温离心机：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；电泳仪BG-Power600：北京百晶生物技术有限公司；热循环PCR 仪：伯乐生命医学产品（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定按照《综合医院结核分枝杆菌感染实验室检查共识》［13］进行分离培养及菌种鉴定。操作人员穿防护服及戴N95 口罩，及在具有负压的AII 生物安全柜内操作。具体操作如下，所获得痰标本经酸碱处理，3 500 r/min 离心沉淀15 min 后取沉淀物0.1 mL 接种于改良罗氏培养基斜面培养上，置于35 ℃恒温培养箱内培养。3、7 d各观察1 次，随后每周观察1 次，取生长培养物行抗酸染色，阳性菌落则观察其在含对硝基苯甲酸（PNB）和噻吩-2-羧基肼（TCH）的培养基上的生长情况，如果PNB 阴性而TCH 阳性则判定为结核分枝杆菌复合群。满8 周培养基斜面无菌生长则判断为阴性。

1.2.2 药敏试验培养阳性的结核菌采用（Mycobacterial Growth Indicator Tube）MGIT960 液体培养法做结核药物敏感试验，各检测药物的浓度及判读标准参照厂家提供的数据。实验操作严格按照相关实验操作规程、仪器或试剂说明书进行。

1.2.3 DNA 提取、PCR 扩增和测序刮取经80 ℃灭活30 min 的L-J 斜面培养基上的结核菌落到含有TE 缓冲液（400 μL）的塑料管中，煮沸10 min 后放于冰块上冷却，13 000 ×g离心5 min，上清液转移到另一个干净的EP管中，-20 ℃保留备用。rpsL，rrs和gidB基因和北京基因型扩增区域105RD 采用的引物见文献［14-15］，所有PCR 扩增采用50 μL 反应体系，包括25 μL 反应MIX、各2.5 μL 正向和反向10 μmol/L 引物、2.5 μL 反应模板及17.5 μL 双蒸馏水。引物及反应试剂由上海生物工程有限公司合成。rpsL，rrs和gidB基因的扩增反应条件为：预变性：94 ℃ 5 min；35 循环（94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。PCR 产物送上海生物工程有限公司测序。

北京基因型及非北京基因型菌鉴别的反应条件为：预变性：94 ℃ 5 min；25 循环（94 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min）；最后72 ℃延伸7 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳后在紫外成像仪下观察、判断结果。非北京家族扩增产物为1 466 bp，而北京家族菌株的扩增产物为761 bp（图1）。

图1 北京基因型及非北京基因型菌鉴别PCR 扩增图Fig.1 PCR amplification map for identifying Beijing genotype and non-Beijing genotype bacteria

1.3 数据分析和统计学方法以结核菌H37Rv（NC 000962.3）为参考菌株，采用BioEdit 软件（版本7.2.5）对测序序列进行排列及突变位点分析。SPSS 26.0软件对数据进行统计分析，两样本间率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本特征及耐药谱本研究收集了106 例非重复的耐多药结核分枝杆菌，链霉素耐药76 例（71.7%）。在链霉素耐药的菌株中，克拉霉素的耐药率57.9%（44/76），其次为乙胺丁醇，耐药率为44.7%（34/76）；在链霉素敏感的菌株中，卡那霉素、左氧氟沙星、氧氟沙星、丙硫异烟氨、环丝氨酸、对氨基水杨酸均敏感，克拉霉素的耐药率为56.7%（17/30），除开SM 敏感株左氧氟沙星耐药率明显低于SM 耐药株外（P＜0.05）外，其他抗生素间无差异（图2）。

图2 106 株链霉素敏感及耐药MDR-TB 对一二线抗生素的耐药图Fig.2 Drug resistance spectrum of 106 streptomycin-sensitive and resistant MDR-TB strains to first- and second-line antibiotics

2.2 rpsL、rrs 和gidB 基因突变特征106 株菌都扩增出rpsL、rrs和gidB基因片段（图3），测序后比对发现58 例rpsL基因出现43A＞G 突变，突变类型为赖氨酸→精氨酸（Lys43Arg），8 例出现88A＞G 突变，突变类型赖氨酸→精氨酸（Lys88Arg）。5 例出现rrs基因突变，主要出现在rrs530 环核苷酸位置的碱基取代，其中2 例为514A＞T、1 例为514A＞C、1例为462C＞T 和1 例为517C＞T。3 例gidB基因突变中，包括1 例102G 缺失及1 例115C 缺失，另有1 例gidB102G 缺失和rpsLLys88Arg 双基因突变，具体结果见表1。

表1 MDR-TB 链霉素耐药结核菌核苷酸突变分布Tab.1 Distribution of nucleotide mutations in streptomycin-resistant MDR-TB

图3 SM 耐药基因rpsL、rrs 和gidB 基因扩增图Fig.3 Amplification maps of SM resistance genes rpsL，rrs，and gidB

2.3 北京基因型结核菌SM 表型耐药特征与基因突变关系本研究共鉴别出94 株北京基因型结核菌，分离率为88.7%（94/106），94株北京基因型菌中，共有69 株发生SM 基因突变，12 株非北京基因型菌中共计4 株出现突变，北京基因型菌突变率明显高于非北京基因型菌（P＜0.05），但SM 的表型耐药两者间差异无统计学意义（表2）。通过分析北京基因型与非北京基因型SM 耐药的突变位点，发现北京基因型菌的rpsL突变主要集中于43A＞G和88A＞G，非北京型菌rpsL突变只出现于88A＞G，未见rrs突变（表3）。

表2 谱系和基因突变与表型耐药情况统计Tab.2 Statistics of genealogy & gene mutations and phenotypic resistance株

表3 北京基因型与非北京基因型SM 突变分布Tab.3 Distribution of SM mutations in Beijing genotype and non-Beijing genotype

2.4 SM 表型耐药与基因突变关系为了解SM 表型耐药与基因突变关系，我们将基因突变与表型耐药进行了比较，7 株表型耐药菌未检测到基因突变，而4 株表型敏感株出现了基因突变，SM 基因型改变与表型符合率为89.6%（95/106）（表4）。通过基因突变预测SM 耐药的敏感度为90.8%（69/76），特异度为86.7%（26/30）。

表4 rpsL、rrs 及gidB 基因对应表型耐药情况Tab.4 Results of rpsL，rrs and gidB genes corresponding to phenotypic drug resistance

3 讨论

SM 抗TB 是通过结合到30S 核糖体亚基干扰蛋白质合成，从而发挥杀菌作用。本研究对106株来源于江西省各地区临床非重复的耐多药结核分枝杆菌临床分离株进行SM 耐药基因rpsL、rrs和gidB的PCR 扩增及序列分析，表型检测显示76 例出现了SM 耐药，耐药率为71.7%，共有73 例检出了基因突变，突变率为 68.87%，基因突变率与广东地区（67.15%）相近［16］，低于国内南方地区（72.48%）［5］，高于西部地区（52.60%）［17］；显著高于伊朗报道（31.25%）［18］，但与缅甸（69.50%）相近［19］，这表明结核菌SM 耐药的基因突变率存在地理差别。本研究显示SM 突变主要集中于rpsL基因，突变类型为43A＞G 和88A＞G，未检测到其他相关突变位点，不同于河北省SM 耐药的rpsL突变位点［14］。此外，我们还发现rpsL43 突变只出现于北京基因型菌中，表明江西地区该位点与北京基因型之间存在紧密关联，但也可能与本研究中的非北京基因型菌分离率过低有关［18，20］。另一项研究表明，rpsL43A＞G突变与高水平SM耐药性相关，rrs突变和gidB缺失突变与低水平耐药性相关，SM不同耐药水平可能取决于rpsL、rrs或gidB基因上突变的位置、基因组背景［19-20］。

本研究发现SM 耐药rrs突变率低（表3），与四川（7.2%）相近［19］，且均出现于北京基因型菌中，表明rrs突变对SM 耐药可能具有潜在贡献。未检测到rrs和rpsL突变共同发生，这表明单基因突变可能会减少对rrs或rpsL的修饰需求［18］。除rpsL和rrs基因突变外，gidB基因突变也被认为与SM耐药具有重要关系［21］。该基因可有错义突变和沉默突变，错义突变与链霉素耐药表型相关更密切［22］。早期的研究观察到gidB基因具有高度多态性［23-24］，说明该基因容易受到外界因素的影响，包括环境改变和抗生素压力等。本研究也表明北京型MDR-TB 更容易出现SM 耐药相关基因突变，这与国内外研究相似［15，24］。大量的研究表明，在感染北京型结核分枝杆菌的情况下，耐药性风险似乎更高，这可能与北京型菌具有更强的适用能力有关［25-26］。

为进一步了解表型耐药与上述基因型突变的关系，我们将基因突变与表型耐药状况进行了比较，结果发现7 株表型耐药菌未出现基因突变，4 株表型敏感出现了基因型突变，这说明还有其他机制介导SM 耐药。例如结核分枝杆菌DosR调节基因Rv2004c 通过氨基糖苷类磷酸转移酶活性介导SM 耐药性，lipF（Rv3487c）基因的表达减少，结核分枝杆菌同型半胱氨酸合酶MetC（Rv3340）的过表达，转录调节因子whiB7 的表达，Tap 外排泵（Rv1258）的过度表达等等［27-30］。

通过对106 株MDR-TB 进行了SM 耐药基因rpsL、rrs和gidB的检测分析，发现基因突变技术预测SM 耐药的敏感度为90.8%，特异度为86.7%，表明联合检测这3 个基因能较为准确地预测SM 耐药性。由于分子生物学检测周期短，结果准确性高，可以为江西地区进一步建立结核分枝杆菌SM耐药性的快速分子诊断方法提供基础。

【Author contributions】YU Shengming：DNA extraction，data analysis and thesis writing；XIA Lianghua：PCR amplification for identification of Beijing genotypes and non-Beijing genotypes；ZHAN Jiahuan：strain screening，data collection and data organization；LIU Siqi：PCR amplification of drug resistance genes；WANG Wei：DNA extraction and data organization；YAN Liang：strain collection，recovery culture，identification and drug sensitivity testing；CHEN Kaisen：overall experimental design and thesis writing Instruction.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.