早产儿视网膜病变患儿血清自噬标志物水平的变化及临床应用价值

2024-01-30吴涛丁苏明詹昶崔雯雯唐卫华

实用医学杂志 2024年1期

吴涛丁苏明詹昶崔雯雯唐卫华

九江市妇幼保健院眼科（江西九江 332000）

早产儿视网膜病变（ROP）是一种发生于早产儿的视网膜血管增生性疾病。ROP 发生的危险因素可归纳为产前因素和产后因素。目前研究认为ROP 相关的产前因素包括出生时低胎龄和低体质量等，产后因素包括出生后暴露于较高的氧气水平以及母胎间相互作用丧失等［1-2］。虽然ROP 的相关因素已有相关研究，但疾病确切的病理生理机制并不明确。随着近些年新生儿学、围产医学的迅猛发展，早产儿、低体质量儿的存活率显著提高，随之而来的ROP 发生率也不断上升［3］。ROP 会导致视力减退、甚至丧失，已成为儿童致盲的首要原因。因此，研究ROP 的病理生理机制有助于发现疾病的诊断标志物、治疗靶点。细胞自噬是广泛存在于真核细胞的生物学过程，生理状态下细胞通过自噬清除衰老及损伤的细胞器、蛋白质，以维持细胞稳态；在缺血缺氧、炎症反应、能力代谢障碍等病理因素的刺激下，适度自噬有利于细胞存活，过度自噬会加重细胞损伤、不利于细胞存活［4-5］。ROP 相关的动物实验结果显示，ROP 动物模型视网膜中自噬水平降低，自噬激动剂改善ROP 病情［6］，提示自噬水平降低与ROP 的发生发展相关。目前ROP 与自噬相关的研究主要集中在动物实验阶段，缺乏相关的临床研究证据支持。基于此，本研究将以ROP 患儿为对象，分析血清自噬标志物的变化及临床应用价值，旨在获得自噬与ROP 关系的临床证据、发现新的ROP 分子标志物。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2020年1 月至2022年12 月期间在九江市妇幼保健院筛查ROP 的早产儿作为研究对象，纳入标准：（1）出生胎龄＜32 周；（2）接受ROP 筛查；（3）临床资料完整；（4）出生第3 天和1、2、3 周时留取血清样本；（5）取得患儿家属知情同意。排除标准：（1）合并先天畸形；（2）其他眼部疾病引起的视力减退，如先天性白内障、青光眼、真菌感染。共纳入210 例早产儿，其中68 例符合ROP 诊断的早产儿作为ROP 组，其余142 例早产儿作为对照组。本研究经医院伦理委员会批准（审批号：LLsc-2022-052）。

1.2 方法及观察指标ROP 的筛查由专门接受过早产儿视网膜病变诊断培训的眼科医生进行，在出生第4 - 6 周时采用Retcam3 数字化眼底广域成像系统（美国科瑞医疗系统公司）进行视网膜检查，参照指南［7］、观察到视网膜血管异常增生作为ROP 的诊断标准，具体分期如下：视网膜颞侧周围的无血管区、有血管区之间有分界线出现为Ⅰ期；眼底分界线有嵴样的隆起改变为Ⅱ期；眼底分界线嵴样病变的基础上有视网膜血管扩张增殖表现，可伴有纤维组织增殖为Ⅲ期；增殖的纤维和血管引起牵拉性视网膜脱落，伴或不伴黄斑脱落为Ⅳ期。Ⅰ-Ⅱ期为轻度ROP、Ⅲ-Ⅳ期为重度ROP。

收集早产儿的临床资料，包括性别、分娩方式、出生体质量、出生时胎龄，是否接受机械通气治疗及吸氧治疗，参照指南判断是否合并脓毒症、支气管肺发育不良。

出生第3 天及第1、2、3 周时，在生化采血管内采集外周静脉血约0.5～1.0 mL，静置0.5 h 凝血后3 000 r/min 离心10 min，分离血清后统一放入-70 ℃冰箱保存。检测时，统一取出血清样本，由同一名人员按照采用LC3-Ⅱ（货号ml063510）、Beclin-1（货号ml060198）、P62（货号ml061499）的酶联免疫吸附法试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）进行实验，检测血清中自噬标志物LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62 的水平，均严格按照试剂盒说明书进行操作，每份血清样本设置3 个复孔。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较进行独立样本t检验，计数资料以例数表示，两组间比较进行χ2检验，血清标志物诊断ROP 的效能采用ROC曲线分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ROP 组与对照组临床资料的比较ROP 组的出生体质量、出生时胎龄均低于对照组，机械通气治疗比例、吸氧治疗比例、脓毒症比例、支气管肺发育不良比例高于对照组（P＜0.05），性别、分娩方式与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 ROP 组与对照组临床资料的比较Tab.1 Comparison of clinical data between ROP group and control group

表2 ROP 组与对照组血清中自噬标志物的比较Tab.2 Comparison of serum autophagy markers between the ROP group and the control group ±s

自噬标志物LC3-Ⅱ出生第3天出生第1周出生第2周出生第3周Beclin-1出生第3天出生第1周出生第2周出生第3周P62出生第3天出生第1周出生第2周出生第3周ROP组对照组t值P值30.48±5.81 27.90±4.19 26.50±3.90 28.09±3.69 32.09±6.73 31.00±6.11 32.26±5.82 32.86±6.27 1.693 3.778 7.400 5.806 0.092 0.001＜0.001＜0.001 107.31±25.83 90.42±20.70 87.58±20.37 92.17±20.43 113.12±25.48 108.46±22.22 111.03±21.94 112.24±22.09 1.536 5.649 7.408 6.310 0.126＜0.001＜0.001＜0.001 5.03±1.51 5.79±1.44 6.07±1.48 5.61±1.44 4.81±1.62 4.93±1.51 4.74±1.49 4.61±1.47 0.941 3.920 6.066 4.643 0.348 0.001＜0.001＜0.001

表3 ROP 组血清LC3-II 水平与临床特征的关系Tab.3 Relationship between serum LC3-II level and clinical features in ROP group ±s

临床特征机械通气出生第3天出生第1周出生第2周出生第3周否（n=9）是（n=59）t值P值吸氧否（n=12）是（n=56）t值P值脓毒症否（n=18）是（n=50）t值P值支气管肺发育不良否（n=38）是（n=30）t值P值28.05±9.59 30.85±5.44 1.036 0.304 33.73±7.68 27.01±3.85 3.432 0.001 30.56±8.12 25.88±3.52 2.524 0.015 32.35±8.58 27.44±3.24 2.761 0.008 29.03±9.57 30.79±5.51 0.645 0.520 32.38±8.14 26.94±3.74 2.803 0.007 33.78±8.72 24.94±3.61 4.590＜0.001 32.48±9.08 27.15±3.31 2.900 0.005 29.29±9.74 30.91±5.33 0.873 0.386 31.62±8.81 26.56±3.55 3.391 0.001 32.33±9.12 24.40±3.52 5.214＜0.001 31.45±9.34 26.88±3.40 2.984 0.004 29.96±6.12 31.14±5.62 0.818 0.416 30.31±5.32 24.85±3.52 4.843＜0.001 29.90±4.85 22.19±3.01 7.619＜0.001 31.90±5.01 23.27±2.89 8.389＜0.001

表4 ROP 组血清Beclin-1 水平与临床特征的关系Tab.4 Relationship between serum Beclin-1 level and clinical features in ROP group ±s

临床特征机械通气出生第3天出生第1周出生第2周出生第3周否（n=9）是（n=59）t值P值吸氧否（n=12）是（n=56）t值P值脓毒症否（n=18）是（n=50）t值P值支气管肺发育不良否（n=38）是（n=30）t值P值105.34±45.41 107.61±26.12 0.175 0.761 118.94±49.12 86.11±20.12 3.049 0.003 124.56±47.67 81.94±19.48 4.095＜0.001 118.59±49.19 88.14±20.71 2.769 0.007 104.65±62.38 107.88±27.12 0.286 0.776 109.65±57.13 86.30±19.45 2.504 0.015 113.57±47.68 82.01±18.95 3.810 0.001 111.96±51.32 87.93±19.12 2.770 0.007 108.48±48.49 106.89±26.75 0.154 0.870 102.11±44.38 86.21±19.12 2.073 0.040 104.55±41.12 81.47±18.94 3.169 0.002 107.25±43.38 86.74±19.32 2.703＜0.001 107.64±24.28 106.34±27.47 0.207 0.837 96.18±22.52 83.12±18.57 2.561 0.013 92.10±22.31 81.85±19.12 2.001 0.048 98.61±21.94 84.01±18.79 2.900 0.005

表5 ROP 组血清P62 水平与临床特征的关系Tab.5 Relationship between serum P62 level and clinical features in ROP group ±s

临床特征机械通气出生第3天出生第1周出生第2周出生第3周否（n=9）是（n=59）t值P值吸氧否（n=12）是（n=56）t值P值脓毒症否（n=18）是（n=50）t值P值支气管肺发育不良否（n=38）是（n=30）t值P值4.83±2.44 5.06±1.44 0.310 0.758 4.48±2.61 5.99±1.39 2.126 0.037 3.84±2.19 6.41±1.40 3.769 0.001 3.84±2.29 5.88±1.54 2.840 0.008 4.94±2.51 5.05±1.49 0.203 0.840 4.43±2.35 6.08±1.62 2.942 0.004 4.29±2.31 6.45±1.62 3.871 0.001 4.12±2.24 5.93±1.67 3.201 0.002 4.81±2.46 5.11±1.44 0.620 0.537 4.76±2.42 6.16±1.65 2.711 0.009 5.15±2.19 6.40±1.59 2.568 0.012 4.55±2.41 5.99±1.59 2.852 0.006 4.93±1.65 5.16±1.84 0.542 0.589 5.36±1.77 6.33±2.14 2.046 0.045 5.56±1.73 6.72±1.84 2.670 0.010 4.95±1.35 6.45±1.94 3.766 0.001

表6 ROP 组中不同病情严重程度患儿血清中自噬标志物的比较Tab.6 Comparison of serum autophagy markers in children with different severity of disease in ROP group

2.2 ROP 组与对照组血清中自噬标志物的比较ROP 组与对照组出生第3 天时的血清LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62水平比较差异统计学意义（P＞0.05）；ROP 组患儿出生第1、2、3 周时的血清LC3-Ⅱ、Beclin-1 水平低于对照组，P62 水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 血清LC3、Beclin-1、P62 水平诊断ROP 的效能出生第1、2、3 周时的血清LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62 单独及联合诊断ROP 的ROC 曲线分别见图1- 3。出生第1周、2周、3周时LC3-Ⅱ诊断的灵敏度分别为64.08%、71.13%、61.97%，特异度分别为70.59%、75.00%、82.35%；Beclin-1 诊断的灵敏度分别为60.56%、68.31%、61.27%，特异度分别为76.47%、77.94%、79.41%；P62 诊断的灵敏度分别为52.11%、67.61%、59.19%，特异度分别为72.06%、77.94%、79.41%三项指标联合诊断的灵敏度分别为80.28%、91.55%、85.21%，特异度分别为95.59%、97.06%、92.65%。

图1 出生第1 周血清LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62 单独及联合诊断ROP 的ROC 曲线Fig.1 ROC curve of serum LC3-Ⅱ，Beclin-1，P62 at the first week of birth alone and combined with ROP diagnosis

图2 出生第2 周血清LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62 单独及联合诊断ROP 的ROC 曲线Fig.2 ROC curve of serum LC3-Ⅱ，Beclin-1，P62 at the second week of birth alone and combined with ROP diagnosis

图3 出生第3 周血清LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62 单独及联合诊断ROP 的ROC 曲线Fig.3 ROC curve of serum LC3-Ⅱ，Beclin-1，P62 at the third week of birth alone and combined with ROP diagnosis

2.4 ROP 组血清LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62 水平与临床特征的关系ROP 组中不同临床特征患儿出生第3 天时的血清LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62 水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），接受机械通气治疗、吸氧治疗以及合并脓毒症、支气管肺发育不良患儿出生第1、2、3 周时的血清LC3-Ⅱ、Beclin-1 水平低于未机械通气治疗、吸氧治疗以及未合并脓毒症、支气管肺发育不良患儿，P62 水平高于未机械通气治疗、吸氧治疗以及未合并脓毒症、支气管肺发育不良患儿（P＜0.05）。

2.5 ROP组中不同病情严重程度患儿血清中自噬标志物的比较ROP 组中重度患儿出生第3 天和1、2、3 周时的血清LC3-Ⅱ、Beclin-1 低于轻度患儿，P62 水平高于轻度患儿（P＜0.05）。

3 讨论

ROP 的发病分为两个阶段，第1 阶段是早产儿视网膜血管发育不良，第2 阶段是缺血缺氧刺激视网膜新生血管及纤维组织大量增生［8-9］。因为ROP 发病的第1 阶段缺乏特异性表现，所以临床实践中根据第2 阶段的临床特征进行ROP筛查。目前筛查ROP 的时机通常为出生后第4 -6 周、筛查手段是眼底检查，此时ROP 已发展至第2 阶段、出现了视网膜血管新生和纤维组织增生，无法早期诊断疾病成为目前限制ROP 临床诊疗的主要因素［10-11］。根据ROP 发病的病理生理特点，研究疾病发病第1 阶段、即视网膜血管发育不良的分子生物学特征，有助于发现ROP 早期的特异性分子标志物，进而发现疾病的诊断标志物及治疗靶点。细胞自噬是一种高度保守的细胞分解代谢过程，受损或过剩的细胞器、蛋白质等细胞成分被隔离在双膜自噬体中，而后转移到溶酶体中形成自噬溶酶体并发生降解和再循环。在缺血缺氧、炎症刺激、能力代谢障碍等病理条件下，自噬激活有助于维持细胞内环境稳定、增强细胞在病理条件下的存活能力。有研究报道，血清自噬标志物Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62 对脑缺血、脓毒症等疾病的病情和预后具有评估价值［12-14］。

本研究对血清自噬标志物作为ROP 诊断及病情评估标志物的价值展开分析。以未发生ROP的早产儿为对照，ROP 患儿出生第3 天时的血清自噬标志物无显著变化，出生第1、2、3 周时的血清Beclin-1、LC3-Ⅱ水平降低，P62水平增加。Beclin-1、LC3-Ⅱ参与自噬溶酶体的形成，对自噬起促进作用；P62 阻碍自噬溶酶体的形成，对自噬起抑制作用。本研究的血清检测结果表明在ROP 发病的第1 周起出现了自噬变化，表现为自噬水平的降低。ROP 相关的动物实验结果显示，ROP 乳鼠视网膜中Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达水平降低，P62 的表达水平增加，与本研究的血清检测结果一致，提示自噬水平降低与ROP 的发病相关。本研究进一步对血清自噬标志物诊断ROP的效能进行了分析，出生第1、2、3 周时的血清Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62 均对ROP具有诊断价值，其中出生第2 周时三项血清自噬标志物联合诊断ROP 的效能最理想、灵敏度和特异度分别达到。

目前自噬相关的研究认为炎症、缺氧等是自噬上游的调控因素，本研究对ROP 发病过程中影响自噬的因素进行了初步探索。ROP 相关的临床研究认为导致ROP 病情加重的临床因素包括机械通气及吸烟治疗、合并脓毒症及支气管肺发育不良［15-16］，本研究对ROP 相关因素与血清自噬标志物的关系进行分析，结果显示：接受机械通气及吸烟治疗、合并脓毒症及支气管肺发育不良与ROP患儿产生后各个时间点的血清Beclin-1、LC3-Ⅱ水平降低，P62 水平增加有关，提示抑制细胞自噬可能是机械通气及吸烟治疗、合并脓毒症及支气管肺发育不良等临床因素导致ROP 发生发展的潜在生物学机制，但相关临床因素与自噬之间的关系仍需要更多的基础研究来验证。

自噬对维持细胞稳态具有积极意义，在缺血缺氧、炎症刺激等病理条件下自噬激活有利于细胞存活、减轻病理条件对细胞和组织的损伤。在ROP 的发病过程中自噬水平减弱会影响细胞内环境稳态，不利于视网膜色素上皮细胞在缺血缺氧状态下存活，进而导致ROP 的发生发展。相关的动物实验结果显示：自噬激动剂改善ROP 乳鼠的视网膜血管异常迂曲、视盘周围无灌注［5，17］，表明自噬激活在ROP 的发生发展中起保护。本研究对ROP 患儿病情与自噬标志物的关系进行了分析，结果显示：与轻度ROP 患儿比较，重度ROP 患儿出生第3 天和1、2、3 周时的血清Beclin-1、LC3-Ⅱ水平降低，P62 水平增加，表明ROP 发病过程中自噬水平降低与病情加重有关，这与自噬激活改善ROP 病情的动物实验结果吻合。

综上所述，ROP 患儿出生第1 周期血清自噬标志物水平发生显著变化，Beclin-1、LC3-Ⅱ水平降低，P62 水平增加，血清三项自噬标志物对疾病具有诊断效能；机械通气及吸烟治疗、合并脓毒症及支气管肺发育不良是导致ROP 发病后自噬水平变化的临床因素，自噬水平降低与ROP 病情加重有关。本研究的以上结果为今后临床诊断ROP 提供了血清标志物，早期准确诊断ROP 有助于指导临床治疗、降低疾病的致盲风险。本研究的主要不足之处在于ROP 的样本量较小，虽然比较了轻度与重度ROP 患儿自噬标志物的差异，但受限于样本量、无法得到自噬标志物诊断轻度与重度ROP的统计学结果，今后需要在临床实践中继续收集ROP 患儿、扩大样本量并深入探索自噬在ROP 中的作用及机制。

【Author contributions】WU Tao collected clinical data，detected the contents of LC3-Ⅱ，Beclin-1，P62 in serum and wrote the article.DING Suming collected clinical data.ZHAN Chang and CUI Wenwen performed the data analysis.TANG Weihua designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.