HS-GC-IMS结合ROAV分析烤烟烟叶“糯米香”特征成分

李舒畅，李 军，高宪辉，刘文霖，常诗瑜，欧泽洁，庞雪莉*，孔凡玉*

HS-GC-IMS结合ROAV分析烤烟烟叶“糯米香”特征成分

李舒畅1,2，李 军3，高宪辉4，刘文霖5，常诗瑜1,2，欧泽洁1，庞雪莉1*，孔凡玉1*

（1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.山东中烟工业有限责任公司，济南 250014；4.云南省烟草烟叶公司，昆明 650218；5.贵州省烟草科学研究所，贵阳 550003）

为准确鉴定烤烟中“糯米香”特征风味化合物，以云南典型“糯米香”（NM）和非“糯米香”（CK）的云烟87烟叶为材料，采用顶空-气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）技术分析其挥发物的组成及相对含量；基于挥发物的相对气味活度值（ROAV）和偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）等统计学方法，鉴定了“糯米香”特征关键标志风味化合物。结果表明，从供试烟叶共鉴定出57种挥发物（包括单体和二聚体），其中2-乙酰基-1-吡咯啉（糯米香），苯乙醛（果香），壬醛（柑橘香）以及2,3-丁二酮（奶甜香）被鉴定为“糯米香”与非“糯米香”烤烟烟叶间的差异性特征风味化合物，其中2-乙酰基-1-吡咯啉是“糯米香”特征的关键贡献化合物，其余3种化合物对烤烟“糯米香”特征香韵具有重要的修饰作用。本研究可能为烤烟“糯米香”特征风味精准调控及评价方法开发提供数据基础。

烤烟；糯米香；挥发性关键风味化合物；顶空-气相色谱-离子迁移谱；相对气味活度值；2-乙酰基-1-吡咯啉

香气是烟草品质评价的核心内容，香韵是烟气所表现出的某种香气韵调。烟草中常见的香韵有干草香、焦甜香、焦香、正甜香、木香、坚果香、辛香、清甜香、青滋香等[1]。近年来，烟草研究工作者以香气品质为育种目标，培育出多种具有特色香韵的烤烟新品种。其中，具有独特“糯米香”香韵的烤烟受到卷烟工业企业广泛关注，该香韵特征被描述为浓烈的糯米香味。前人围绕“糯米香”特征烤烟的化学成分和香气组分开展了初步探究[2-4]，试图解析烤烟“糯米香”特征的关键物质基础。现有大部分研究多采用GC-MS、LC-MS等常规手段分析化学成分的差异，均未明确鉴别出烤烟中“糯米香”特征风味的关键贡献化合物。本研究组前期利用现代分子感官科学技术，基于气相色谱嗅觉检测/稀释嗅闻技术（GC-O/AEDA）以及多维气相色谱-高分辨质谱联用技术（GC*GC-QTOF/MS），将烤烟烟叶“糯米香”特征成分初步鉴定为2-乙酰基-1-吡咯啉[5]。但是，前期仅鉴定出一种特征风味化合物，“糯米香”烤烟烟叶中是否还存在其他特征风味化合物，需采用更高灵敏度和精确度的仪器分析手段结合统计学方法进行深入研究。

顶空-气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）是一种用于分离和鉴定复杂基质中痕量挥发性有机化合物的新型分析方法，可基于不同离子在电场中气相迁移速度的差异来表征化学离子物质[6]。该方法以操作便捷的顶空方式进样，无需复杂的样品前处理，同时结合了气相色谱（GC）的高分离能力和离子迁移光谱（IMS）的快速响应性能，具有响应速度快、灵敏度高、分析效率高、成本低廉等多重优势[7-8]，该技术在烟草挥发物的鉴定[9]和挥发物差异分析[10]方面得到了较为广泛地应用。为准确鉴定烤烟烟叶中“糯米香”特征风味化合物，对前期研究结果[5]进行补充验证，本研究采用了更高灵敏度和精确度的HS-GC-IMS，引入相对气味活性值的概念（ROAV），借助主成分分析、偏最小二乘法判别分析、聚类分析等统计学手段，对典型“糯米香”与非“糯米香”烟叶中差异性挥发物进行精确筛选和鉴定，以期明确烤烟“糯米香”特征风味的关键物质基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取云南曲靖地区大田长势相同、成熟度一致的云烟87烤后烟叶，参照GB 2635—1992挑选中部橘黄1级（C1F）烟叶作为试验样品；经专业卷烟感官质量评吸委员会10位专家评吸鉴定，确定具有典型“糯米香”特征样品（NM1、NM2）和非“糯米香”特征对照组（CK）样品做为本研究试验样品。

1.2 仪器与试剂

2-乙酰基-1-吡咯啉标准品（98%），加拿大TRC公司；其他香气标准品均购自北京百灵威科技有限公司；C4～C9正构烷酮标准品（99%），美国Sigma-Aldrich公司；无水乙醇（色谱纯），美国AVANTOR公司；FlavourSpec®风味分析仪（配有CTC自动顶空进样器），德国G.A.S公司；电子天平（感量0.000 1 g），瑞士梅特勒托利多公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理 烟叶样品去脉、切丝后于30 ℃下干燥处理并研磨过筛（60目）。分别称取0.5 g烟末样品于顶空瓶中，80 ℃、500 r/min孵育15 min后，用气密样针（85 ℃）抽取顶空气（500 μL）进行GC-IMS分析，每个样品平行处理3次。

1.3.2 GC-IMS分析 不分流模式；MXT-5型色谱柱（15 m×0.53 mm×1.0 μm）；柱温60 ℃；载气/漂移气为高纯N2（纯度≥99.99%）；载气初始流速为2 mL/min，保持2 min，在20 min内线性上升至100 mL/min；漂移气流速为150 mL/min，IMS柱温45 ℃。

1.3.3 相对气味活度值（Relative odor activity value, ROAV）计算 参照刘登勇等[11]方法，将对样品总体风味贡献最大的挥发性组分的ROAV定义为100，其他组分的ROAV值由下列公式计算得出：

式中，CT分别为各挥发物的相对含量（%）和对应的空气中觉察阈值；stanstan分别为对整体风味贡献最大挥发物的相对含量（%）和空气中觉察阈值。通常认为，ROAV≥1的挥发物为待测样品总体风味的主要贡献者[12]。

1.3.4 供试烟叶挥发性组分定性、定量分析 通过正构烷酮校准保留时间，比对GC-IMS中内置NIST气相保留指数数据库和IMS迁移时间数据库对典型“糯米香”与非“糯米香”烟叶挥发性组分进行定性，并利用峰面积归一法计算定性化合物的相对含量。

1.3.5 香味物质添加试验 参照YCT 138—1998[13]，将一定浓度梯度的2-乙酰基-1-吡咯啉乙醇溶液分别注入4组（10支/组）标准烟支中，以10支注入相同量无水乙醇的标准烟支作为空白对照，由10名专家级感官评价员采取9分制（强，7～9；中等，4～6；弱，1～3；无，0）对卷烟“糯米香”香气强度进行量化评价。

1.4 数据处理

利用GC-IMS配套软件VOCal查看谱图，通过Library Search软件进行定性分析，利用Reporter和Gallery Plot插件对指纹图谱进行对比分析，采用SIMCA 14.1软件进行PCA和OPLS-DA分析，采用IBM SPSS 27.0和Excel软件进行数据分析及作图。

2 结 果

2.1 典型“糯米香”与非“糯米香”烟叶中挥发性风味组分构成

由烟叶挥发性组分的GC-IMS二维谱图（图1）可知，典型“糯米香”与非“糯米香”烟叶样品挥发物的GC分离效果较好，且3组不同样品中挥发物的种类大致相同，但不同样品中挥发物的含量存在一定差异。如在保留时间为300 s、400 s和500 s时，均可观察到斑点的颜色在不同样品间出现了较为明显的变化（图1黄框所示），表明烟叶挥发物含量差异是形成烤烟“糯米香”特征风味的因素之一。

基于HS-GC-IMS分析，在3组供试样品中共检测到91种共有挥发物，其中57种得以准确定性（包括单体和二聚体）（表1），物质种类构成丰富，包括20种醛类、11种酮类、11 种含氮杂环类、8种酯类、2种酸类、2种醇类、2种醚类和1种含氧杂环类。由不同烟叶挥发物的含量分布指纹图谱（图2）可以直观看出：典型“糯米香”与非“糯米香”烤烟烟叶中挥发物组成及含量分布呈现较大差异。具体来看，5-甲基-2(3H)-呋喃酮、2,6-二甲基吡啶、3-庚醇、2-甲基四氢呋喃-3-酮、壬醛、苯乙醛、E,E-2,4-庚二烯醛、2-乙基-5-甲基吡嗪、环己酮、丙烯酸丁酯、2-己烯醛、辛醛、E-2-辛烯醛、E,Z-2,6-壬二烯醛、异戊烯醛、醋酸甲酯、癸醛、糠醛、2,3-丁二酮、2-乙酰基-1-吡咯啉等组分在试验组中相对含量明显高于对照组（图2红框所示，＜0.05）；2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、丙酮、2-甲基丙烯醛、2-丁酮、1,4-二氧六环、苯甲醛、3-羟基丁酸乙酯、E-2-甲基-2-丁烯醛、异丁醇、γ-丁内酯、E-2-辛烯醛、3,5-二甲基-1,2-环戊二酮、5-甲基-2-庚烯-4-酮、苯甲酸乙酯、葫芦巴内酯、二丙基硫醚、4-甲基-3-戊烯-2-酮、2-乙酰呋喃等组分的相对含量在对照组明显高于试验组（图2黄框所示，＜0.05）。

图1 典型“糯米香”与非“糯米香”烟叶中挥发性组分的GC-IMS二维谱图

表1 基于HS-GC-IMS分析的典型“糯米香”与非“糯米香”烟叶中挥发性风味组分构成

表1 （续）

注：挥发性风味组分中的M为单体，D为二聚体，同行不同字母表示具有显著差异（＜0.05），下同。

Note: “M”represents monomer and “D” represents dimer in volatile flavor compounds. Different letters indicate significant differences (< 0.05). The same as below.

图2 典型“糯米香”与非“糯米香”烤烟烟叶中挥发性风味组分的指纹图谱

2.2 基于相对气味活性值（ROAV）的挥发性风味化合物的香气贡献评价

典型“糯米香”与非“糯米香”烤烟烟叶中相对气味活性值（ROAV）≥1的香气组分共14种（表2），其中2-乙基-3,5-二甲基吡嗪在试验组和对照组样品中均呈现最高的气味贡献值（ROAV=100），其他较重要的共有香气物质还包括壬醛、苯乙醛、2-乙酰基-1-吡咯啉（ROAV＞10）。“糯米香”烤烟的关键特征风味化合物的鉴定还需进一步综合气味属性，对典型“糯米香”与非“糯米香”烤烟烟叶的差异风味化合物进行多维度筛选判别[14]。

表2 典型“糯米香”与非“糯米香”烟叶中挥发性组分的相对气味贡献值（ROAV）

注：觉察阈值数据参考GEMERT[15]，为空气中的阈值。

Note: The sensory threshold data of aroma compounds refer to GEMERT[15], which is the threshold in the air.

2.3 基于OPLS-DA筛选典型“糯米香”与非“糯米香”烟叶的标志性差异物

对三组样品中挥发性组分的ROAV值进行偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA），利用变量重要性投影值（Variable importance projection, VIP）筛选试验组与对照组中的关键差异性风味化合物，将同时满足VIP＞1且＜0.05的组分定义为不同“糯米香”香气强度烤烟烟叶样品的差异性标志物[16]。由图3A和图3B可以看出，对照组和试验组中关键风味物质构成差异较大，其中2-乙酰基-1-吡咯啉（VIP=3.000 32，糯米香，单体），苯乙醛（VIP=2.424 76，果香，单体），壬醛（VIP=1.774 07，柑橘香，单体），2,3-丁二酮（VIP=1.583 19，奶甜香），乙酸（VIP=1.509 22，酸味，单体）是关键差异风味组分（图3B红框所示）。模型置换验证结果（图3C）显示，2(cum)=0.986，2(cum)=0.994，2(cum)=0.978，右侧的2和2均高于左侧，且2与轴交于负半轴，表明模型未出现过拟合现象，有较高的可信度和较好的预测能力。

图3 典型“糯米香”与非“糯米香”烟叶中挥发性组分的OPLS-DA得分图（A）、VIP值图（B）、模型置换验证图（C）

2.4 典型“糯米香”与非“糯米香”烟叶中差异性风味标志物的含量分布特征

由“糯米香”与非“糯米香”烟叶中差异性风味标志物的聚类热图（图4）可知，除乙酸外，其余4种差异性风味标志物，包括2-乙酰基-1-吡咯啉（糯米香）、苯乙醛（果香）、壬醛（柑橘香）以及2,3-丁二酮（奶甜香）在试验组中的含量均显著高于对照组。其中2-乙酰基-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline, 2AP）拥有最高的ROAV值和最高的VIP值，且具有典型糯米香味特征，极有可能为烤烟“糯米香”特征的直接关键风味贡献化合物，需进一步结合香味物质添加试验对其香气贡献进行验证。

2.5 2AP对“糯米香”风味贡献的添加验证

如表3所示，与对照相比，添加4个浓度梯度2AP的卷烟均产生了足以被实验员感知到的糯米香味特征，且10名实验员给出的香气强度赋分值的相对标准偏差（RSD）仅为7%，表明数据的离散程度相对较小，结果具有较高的可信度，由此验证了2AP对烤烟“糯米香”特征风味的直接贡献作用，即2AP为烤烟“糯米香”的直接关键风味贡献化合物。

图4 典型“糯米香”与非“糯米香”烟叶标志性差异物的聚类热图

表3 卷烟香味物质添加试验评吸结果

3 讨 论

烟草的风味是由其香气组分的含量及觉察阈值共同决定[17]，在分析关键风味化合物时不应局限于“以量定效”的原则[18]。相对气味活度值法（ROAV）是一种基于觉察阈值和相对含量来客观描述香气组分对样品香气风格贡献值的一种常用方法，可用来考察对样品风格有决定性影响和修饰作用的香气组分[19]，而将ROAV法与统计学分析方法结合，可实现复杂基质中特征香韵关键风味化合物的精确鉴定[20]。

本研究通过ROAV法结合PCA和OPLS-DA等统计学分析发现，2-乙酰基-1-吡咯啉具有浓烈的糯米香味特征和极低的觉察阈值（0.02 μg/kg）[21]，是烤烟“糯米香”风味的关键化合物；苯乙醛、壬醛、2,3-丁二酮也是“糯米香”与非“糯米香”的关键差异风味组分。2-乙酰基-1-吡咯啉为含氮杂环类碱性物质，验证了李振杰等[4]研究中相比于普通烤烟，典型“糯米香”烤烟含有更多的碱类物质的结果。李勇等[2]、张志明等[3]和焦天雷等[22]在烤烟“糯米香”特征香韵解析研究中都曾提出，苯乙醛、壬醛等醛类化合物在典型“糯米香”烤烟中占比较高，这一结论也与本研究的结果相吻合。

烤烟“糯米香”香韵的香气构成十分丰富，除了类似糯米的香气特征最为突出，还包括了甜香、花香等香气特征[23]。壬醛、苯乙醛、2,3-丁二酮均为前人报道的烟草重要香气成分，呈现果香、花香和奶甜香等香气特征，有助于掩盖杂气、削弱刺激、改善吃味、增强回甘[24-25]，可协助彰显烤烟典型“糯米香”香韵风格特征，对烤烟“糯米香”特征香韵具有重要的修饰作用。由于烟草整体香韵风格的产生并非各香气组分的简单加和，而是通过复杂的协同作用形成。因此，3种不具有直接“糯米香”贡献的差异醛酮类香气化合物（壬醛，苯乙醛，2,3-丁二酮）是否可以和2AP协同作用，进一步彰显烤烟“糯米香”风味特征，还需通过阈值法、S型曲线法、OAV法等香气协同作用研究方法进行深入研究。另外，前人均证实高含量的生物碱类物质是“糯米香”烤烟的主要化学特征，因此，今后还可围绕生物碱类前体与2AP转化的关联性开展深入剖析。

4 结 论

本研究基于HS-GC-IMS和挥发物阈值信息，明确了典型“糯米香”和非“糯米香”烤烟烟叶中挥发性风味化合物组分构成、分布特征和相对气味贡献（ROAV）。基于ROAV值和统计学分析，筛选出4种烤烟“糯米香”特征的标志风味化合物，其中2-乙酰基-1-吡咯啉（糯米香）具有最高的相对气味活度值（ROAV）和最高的变量重要性投影值（VIP），是烤烟“糯米香”特征的直接关键贡献化合物；壬醛（柑橘香）、苯乙醛（果香）以及2,3-丁二酮（奶甜香）有助于掩盖杂气、削弱刺激、改善吃味、增强回甘，对烤烟“糯米香”特征香韵具有重要的修饰作用。研究采用更高灵敏度和精确度的仪器分析手段结合统计学方法，对前期研究结果进行了补充验证，可为烤烟糯米香特征风味精确评价方法创新开发及基于分子育种技术的糯米香特征风味调控研究提供数据支撑和理论基础。

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Analysis of Characteristic “Glutinous Rice”-like Aroma-active Odorants in Flue-cured Tobacco Leaves Based on HS-GC-IMS Combined with ROAV

LI Shuchang1,2, LI Jun3, GAO Xianhui4, LIU Wenlin5, CHANG Shiyu1,2, OU Zejie1, PANG Xueli1*, KONG Fanyu1*

(1.Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 2.Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3.China Tobacco Shandong Industry Co., Ltd., Jinan 250014, China; 4.Yunnan Tobacco Leaf Company, Kunming 650218, China; 5.Tobacco Science Institute of Guizhou Province, Guiyang 550003, China)

In order to accurately identify the potent odorants in flue-cured tobacco (FCT) leaves with “glutinous rice”-like characteristic, different Yunyan 87 tobacco leaves with or without typical “glutinous rice”-like characteristic from Yunnan province were used as materials in this study. Firstly, volatile compositions and their relative content was analyzed by headspace-gas chromatography-ion migration spectroscopy (HS-GC-IMS). Then, the differential volatile markers between typical “glutinous rice”-like and non-“glutinous rice”-like tobacco leaves samples and the key chemical contributors to the “glutinous rice”-like characteristic were identified based on the relative odor activity value (ROAV) combined with orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA). A total of 57 common odorants (including monomers and dimers) were identified. 2-Acetyl-1-pyrroline (“glutinous rice”-like), benzene acetaldehyde (fruity), nonanal (citrus-like), and 2,3-butanedione (sweet, buttery) are characterized as differential flavor compounds between typical “glutinous rice”-like and non-“glutinous rice”-like tobacco leaves samples, among which 2-acetyl-1-pyrroline is a key contributor to “glutinous rice”-like aroma, the other three compounds play an important role in modifying “glutinous rice”-like characteristic flavor of FCT. The results herein would provide chemical basis for the accurate regulation and the evaluation method development for “glutinous rice”-like characteristic odorants in FCT.

flue-cured tobacco; “glutinous rice”-like aroma; volatile key odorants; headspace-gas chromatography-ion migration spectroscopy (HS-GC-IMS); relative odor activity value (ROAV); 2-acetyl-1-pyrroline

TS41+1

A

1007-5119(2023)06-0075-09

中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-TRIC07）；中国烟草总公司云南省公司科技项目（2021530000241011）；中国烟草总公司贵州省公司科技项目（2021520000240044）

李舒畅（1999-），男，在读硕士研究生，研究方向：食品质量与安全。E-mail：3242309079@qq.com*通信作者。E-mail：庞雪莉，pangxueli@caas.cn；孔凡玉，kongfanyu123@126.com

2023-08-01

2023-10-23

10.13496/j.issn.1007-5119.2023.06.011