不同产地藤茶二氢杨梅素含量检测与分析

夏绪红 刘庆兰 陶小庆

（贵州省铜仁市检验检测院，贵州铜仁 554300）

藤茶（Ampelopsis grossedentata）又称莓茶、白毛猴，是一种显齿蛇葡萄科的药食两用植物，广泛分布在我国西南及中部的山林地区[1]。藤茶叶是藤茶入药和食用的主要部分，为二回羽状复叶，基部一对小叶常为3 小叶或稀为羽状复叶，小叶长椭圆形或卵圆形，长4～12 cm，宽2～6 cm，顶端渐尖，基部微心形或圆形，边缘每侧有3～15个粗锯齿[1-2]。藤茶具有清热利湿、平肝降压和活血通络的功效，可用于治疗痢疾、泄泻、小便淋痛和头昏目胀等疾病[2]。研究表明，藤茶含有超过10种矿物质，其中铁、铜、锰、锌和硒的含量较高[1]；天然野生藤茶有消炎止咳作用，对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等有明显的抑制作用[3]；藤茶的主要功能成分包括氨基酸、黄酮类及矿物质等，其中黄酮类物质含量丰富[3-4]，总黄酮含量超过总多酚的45%，其中二氢杨梅素（Dihydromyricetin，DMY）含量相对较高，可达叶干重的25%～35%（w/w）[5]。DMY又称蛇葡萄素，属于黄酮类有机化合物，分子式为C15H12O8，化学式为（2R，3R）-3，5，7-三羟基-2-（3，4，5-三羟基苯基）苯并二氢吡喃-4-酮[1，6]。研究表明，DMY 是藤茶的主要生理活性成分，具有抗氧化[3]、预防心血管疾病[7]、缓解糖尿病[8]、抗血栓[9]以及调节肠道菌群[10]等功效。DMY可以防治肝纤维化及脂肪肝，通过降低导致肝纤维化TGFβ1 的水平，降低肝脏内丙二醛含量，提高机体抗氧化水平从而防治肝纤维化[3，11]；DMY 还可以通过降低肝脏腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化水平，降低脂质沉积来保护肝脏[6]。此外，DMY具有广谱抑菌效果，对金色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌等细菌均有抑制作用[12]，其通过抑制菌体的呼吸代谢、破坏菌体的结构形态及改变细胞膜的渗透性[3-4]等发挥抑菌功能。

作为茶饮，藤茶口味独特，加之其独特的保健作用，具有很好的市场潜力。研究发现，不同种类藤茶中的DMY含量存在一定差异[13-14]。但对不同产地、不同采收时间和不同等级藤茶之间的DMY 含量差异研究相对较少。

本试验通过收集具有代表性的a、b、c 及d 区域的不同时期3 种不同类型（按等级分）的藤茶（叶为主），采用热水浸提方法提取不同藤茶中的DMY；并利用HPLC 分析不同藤茶中DMY 的含量，为藤茶引种、种植及加工利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

试剂：甲醇（色谱纯，默克股份有限公司）；磷酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；DMY 对照品（98%，上海莼试生物技术有限公司）。

设备：高效液相色谱仪（Thermo UtiMate3000）；电子天平（1/105，梅特勒—托利多）；数控超声波清洗器（KQ5200DE，昆山市超声仪器有限公司）；高速粉粹机（FW100，天津市泰斯特仪器有限公司）；隔膜真空泵（GM-0.33A，天津市津腾实验设备有限公司）；色谱柱：Diamonsil 5um C18（2），150×4.6 mm（3859090）。

1.2 试验材料

本试验所用藤茶来源于a区域某生物科技有限公司、b 区域藤茶生物科技有限公司、c 区域藤茶茶业厂、d 区域藤茶有限公司。4 月采摘时间为20—26 日，5 月采摘时间为23—29 日，6 月采摘时间为21—28日，7月采摘时间为20—25日。不同等级藤茶的分级标准[1-2，12]如表1所示，分级特征如图1所示。

图1 藤茶分级参考标准

表1 藤茶等级分级标准

1.3 试验方法

1.3.1 DMY 的提取DMY 的提取方法参照文献[13]并适当修改。精确称取1.0 g 干燥藤茶叶，按料液比（1∶100，w∶v）加入70 ℃的热水，磁力搅拌下浸提40 min。浸提结束后进行抽滤，滤渣按上述方法浸提一次并抽滤，合并滤液后，旋转蒸发浓缩至约1/2 体积，将浓缩液以0.22 μm 滤头过滤后贮藏（-20 ℃），待测。

1.3.2 DMY 含量的测定DMY 含量的测定参照文献[14]，采用液相色谱法测定藤茶原料中DMY 的含量，具体条件如下。

（1）色谱条件与系统适应性试验。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇∶0.05%磷酸（55∶45）为流动相；检测波长291 nm；理论塔板数按DMY计算应不低于3 000。

（2）对照品溶液的制备。精密称取DMY对照品20.0 mg，置25 mL 量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，经0.45 mm滤膜过滤，制成0.8 mg/mL贮备液，测定时从贮备液中吸取1～10 mL 容量瓶中，以甲醇稀释至刻度，制得0.08 mg/mL DMY 对照溶液，备用。

（3）供试品溶液的制备。将干燥藤茶待检样品或藤茶植物干燥嫩茎叶粉碎后过60目筛，精密称定0.5 g 置于25 mL 容量瓶中，加入甲醇20 mL，超声30 min，放置室温，用甲醇定容至25 mL，摇匀后精密量取样液1.0 mL，置100 mL 量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 mm滤膜过滤后备用。

（4）分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定；本品按干燥品计算，含DMY不得低于18%。

采用外标法计算供试品溶液中DMY含量，样品中DMY含量（W）计算公式如下。

式中，A1为样品溶液中DMY 的峰面积；AS为对照品溶液中DMY 的峰面积；C为对照品溶液中的质量浓度（mg/mL）；m为试样的质量（g）。

1.3.3 数据处理每次试验重复3 次，结果以均值±标准差表示，数据单因素方差分析采用SPSS 22.0软件，并利用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同产地不同等级藤茶中DMY含量

不同产地不同等级藤茶中DMY 含量如图2 所示。不同区域相同等级藤茶中含DMY 含量范围为23%～36%，其中a 区域藤茶的DMY 含量最高，特级藤茶达到36.2 g/100 g dw，与其他地区同等级的DMY含量存在显著差异，其次为d区域和c区域产藤茶，DMY含量在31.0～32.0 g/100 g dw；b区域产藤茶含量最低，平均28.5 g/100 g dw。相同区域不同等级藤茶之间DMY含量也存在不同程度的差异，特级藤茶最高，一级藤茶次之，二级藤茶最低，均未达到显著差异。

图2 不同区域不同等级藤茶DMY含量

2.2 不同采摘时间的藤茶中DMY含量

不同区域不同等级藤茶在不同采摘时间的DMY 含量如图3 所示。不同区域在相同采摘时间的DMY 含量具有明显差异，均表现为a 区域藤茶中DMY 含量最高，c、d 区域藤茶中DMY 含量次之，b 区域藤茶中DMY 含量略低；相同区域中各同等级藤茶在不同采摘时间之间的DMY 含量无显著差异。

图3 不同区域不同等级藤茶在不同采摘时间的DMY含量

3 结论与讨论

不同区域藤茶干物质中DMY 含量在21.2～36.2 g/100 g，相同等级藤茶中，a 区域产藤茶DMY含量最高，可达30.9～36.2 g/100 g；相同产地不同等级藤茶之间，特级藤茶DMY 含量高于一、二级藤茶，但未达到显著水平。这与相关研究结论相符，Ye 等[14]检测藤茶中DMY 含量为22.6%（w/w），Hu等[15]在广西藤茶中DMY 含量检测中，得出含量为12.2%（w/w），Li 等[16]采用微波辅助提取法提取武夷山藤茶时，通过优化提取条件，DMY 最高提取率可达85%，Zhen 等[17]采用超声提取法提取藤茶DMY，提取率可达86%。即不同产地和不同提取方法可能影响DMY 的提取率，进而影响分析结果。同时，提取溶剂、提取温度、提取时间、料液比和pH等因素对DMY 的提取率均有不同程度的影响[16-18]。值得注意的是，不同品种及不同采收时间也可能会影响藤茶中各类化学成分的含量及检测结果。

本研究结果中，相同产地相同等级藤茶之间，不同采摘时间的藤茶DMY含量没有明显差异，这与相关研究结论[19-20]存在差异，胡百顺等[20]发现藤茶DMY、花旗松素、多酚及DMY异构体含量在5月最高。产生差异的主要原因可能是本研究中藤茶样品在试验期间保存不够严格，早期采摘藤茶样品中黄酮可能被氧化降解，最终导致不同采摘时间样品间的差异不显著[21]。不同产地及不同等级藤茶之间的DMY含量存在明显差异，实际应用中可根据需求加以选择。

不同产地相同等级藤茶之间DMY 含量存在显著差异，相同产地不同等级藤茶之间也有差异，而不同采摘时间之间没有显著差异。即产地和等级对藤茶DMY 含量具有显著的影响。根据相关研究[6，14]，产生差异的主要原因可能是不同区域藤茶所处的气候环境不同，如温度、湿度和光照等方面存在差异[3]。也有可能是DMY 存在同分异构体，一般检测手段难以区分，检测结果准确度有待提高[4，15]。此外，不同区域藤茶的基因可能也存在明显差异，导致DMY 含量不同[11]。因此，产生差异的原因有待进一步深入探究。

本试验通过收集具有代表性的a、b、c 及d 区域的不同时期3 种不同类型（按等级分）的藤茶（叶为主），采用热水浸提方法提取不同藤茶中的DMY；并利用液相色谱法分析了不同藤茶中DMY的含量，为藤茶引种、种植及加工利用提供参考。