Wnt/β-catenin 信号通路在心肌纤维化中的作用研究进展

高雅婷 邱对鑫 高 磊 石开虎

1 南京中医药大学附属中西医结合医院（江苏南京 210028）

2 南京中医药大学，中医学院·中西医结合学院（江苏南京 210023）

1 Wnt/β-catenin 信号通路

1.1 概述

Wnt基因最初来源于小鼠乳腺癌中的整合酶-1和果蝇的无翅基因，由于这两个基因和功能蛋白相似，研究者将其合并为Wnt基因［1］。Wnt信号通路包括非经典通路和经典通路，Wnt/β-catenin信号通路是Wnt信号通路中的经典通路，Wnt/β-catenin信号通路是一种进化上高度保守的信号通路，对胚胎发育、器官和神经发育、损伤修复及组织稳态等至关重要［2-3］。Wnt分泌的糖蛋白充当配体并调节下游效应β-catenin蛋白［4］。Wnt/β-catenin信号通路包括四个部分：细胞外信号、细胞膜段、细胞质段和细胞核段。细胞外信号主要由Wnt蛋白介导，包括Wnt3a、Wnt1、Wnt5a等。细胞膜片段主要含有Wnt受体Frizzled（特异性卷曲跨膜受体Frizzled蛋白）和共同受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（low-density lipoprotein receptor-related protein 5 and 6，LRP 5/6）。细胞质段主要包括β-catenin、细胞质折叠蛋白（dishevelled，DVL）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）、轴蛋白（axis inhibition protein 2，Axin）、腺瘤性结肠息肉蛋白（adenomatous polyposis coli protein，APC）和酪蛋白激酶I（casein kinase 1，CK1）。细胞核段主要包括移位到细胞核的β-catenin、T细胞因子（T cell factor，TCF）/淋巴细胞增强因子（lymphoid enhancing factor，LEF）家族成员和β-catenin蛋白下游靶基因，如基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和细胞-骨髓细胞瘤病病毒癌基因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）等［3］。一般情况下β-catenin蛋白通过与转录因子的TCF/LEF相互作用来激活靶基因从而控制细胞增殖［5］。Wnt信号通路在人体组织中通常为沉默，但在损伤后重新激活。Wnt信号通路沉默时，分泌的卷曲相关蛋白（secreted frizzled-related protein，SFRP）与Wnt结合，细胞质中的β-catenin 被 Axin、CK1、APC、GSK-3β组成的复合物不断降解。当组织受到损伤时，Wnt信号通路被激活，Wnt与卷曲跨膜受体Frizzled及其共同受体 LRP5/6 结合，使这种复合物的下游蛋白DVL被磷酸化，抑制GSK-3β和CK1的活性，并固定Axin，破坏复合物的形成，从而抑制β-catenin降解，β-catenin就可以稳定化聚集并转移到细胞核中与TCF/LEF相互作用，调节基因表达。见图1。

图1 Wnt/β-catenin 通路示意图

1.2 Wnt/β-catenin与多种纤维化疾病相关

近年来的研究表明，Wnt/β-catenin的信息通路在各类纤维化病变，如肺纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、肾纤维化以及心肌纤维化的发病过程与病程进展中起着主要作用［6-7］。如肺纤维化，有研究者通过让小鼠吸入聚苯乙烯微塑料激活氧化应激和Wnt/β-catenin信号通路诱导小鼠肺纤维化［8］。Lei等［9］研究发现，Wnt/β-catenin激动剂SKL2001降低脂肪酸结合蛋白5（fatty acid binding protein 5，FABP5）敲低在转移生长因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）刺激下对肺外源成纤维细胞的抗纤维化作用。在急性肾损伤中，短暂被激活的Wnt/β-catenin信号通路诱导修复和再生，而持续（不受控制）激活的Wnt/β-catenin信号通路促进与慢性肾脏病相关的肾脏纤维化、足细胞损伤和矿物质骨病［10］。此外，Wnt/β-catenin信号通路在皮肤纤维化中也有重要作用，Jussila等［11］证明了跨膜二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase-4，DPP4）是一种Wnt/β-catenin响应基因和纤维化转化的功能介质，此研究将Wnt/DPP4轴确定为细胞外基质稳态和真皮脂肪减少的关键驱动因素，为减轻组织纤维化的发生和逆转提供了作用途径。其中尤为重要的是其对心肌纤维化的作用。

2 心肌纤维化在心血管疾病中的作用

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是影响全球死亡率的首要因素。在中国，CVD一直是导致中国城乡居民死亡的最主要因素，但近年来由于老龄化问题加重，CVD相关死亡率也持续升高，已严重威胁民众的生命安全。据研究显示，2019年农村和城市CVD死亡人数分别占总死亡人数的46.74%和44.26%，每5例死亡者中就有2例死于CVD［12］。在CVD中，明确其病理机制，研究疾病靶点并开发新型治疗药物尤为重要。大多数CVD与心肌纤维化相关，它几乎代表了所有类型心脏损伤的最终病理表现［13］。心肌纤维化的特征在于细胞外基质的过度沉积和心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）的积聚。CFs是成人心脏中的主要细胞类型，是细胞外基质的主要生产者，并且显著促进心肌纤维化［14］。在心脏受到损伤后，CFs 被激活并随后分化为肌成纤维细胞，后者是病理性重构的主要作用细胞。肌成纤维细胞具有增殖和分泌特性，有助于细胞外基质周转和胶原沉积［15］。

3 Wnt/β-catenin 在心肌纤维化相关CVD 中的作用

大量研究结果表明，Wnt/β-catenin信号通路与心肌梗死、心房颤动、心力衰竭等多种CVD相关，异常的Wnt/β-catenin信号通路激活会导致心功能不全的发生和进展，在各种CVD中Wnt/β-catenin信号通路与心肌纤维化的关系最为密切。

3.1 心肌梗死

急性心肌梗死通常由血栓阻塞动脉或旁路移植物引起，其特征是流向心肌的血流突然减少，最终导致心力衰竭和死亡［16］。Wnt/β-catenin信号通路参与心肌梗死后细胞凋亡、心肌纤维化和毛细血管增生的病理过程，影响心肌梗死患者的预后［17］。Liu等［18］通过体内实验证明了沙库巴曲/缬沙坦通过抑制Wnt/β-catenin通路减轻CFs中的胶原沉积从而减轻心肌梗死后小鼠的心肌纤维化并改善心功能。Zhang等［19］发现，富含脯氨酸/精氨酸的末端富含亮氨酸的重复蛋白（proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein，PRELP）的过度表达增加了梗死的大小和间质纤维化面积，位于PRELP下游的Wnt/β-catenin通路分子的表达在PRELP过表达组中比在心肌梗死组中增加更多。最近的一项研究也同样发现，心肌梗死与Wnt/β-catenin通路密切相关，并证实XAV93（一种 Wnt/β-catenin信号通路阻滞剂）可以通过促进β-catenin的降解，成功阻断心肌梗死后心肌细胞中的Wnt/β-catenin通路激活［20］。近期一项研究将急性心肌梗死 PCI患者分为两组，研究组术中使用替罗非班，对照组不使用替罗非班，通过对比观察到治疗后两组Wnt/β-catenin表达水平较治疗前均明显降低，研究组Wnt/β-catenin表达水平显著低于对照组，这表明了替罗非班对急性心肌梗死的治疗作用可能是通过对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用［21］。Hind等［22］采用GSK-3β全身性基因敲除小鼠模型，在心肌梗死后GSK-3β全身性基因敲除的小鼠心脏中纤维化反应增多，GSK-3β通过直接调节经典TGF-β1-SMAD-3信号通路发挥在梗死心脏中心肌纤维化重塑的核心作用。这些数据表明，GSK-3β是受损心脏中心肌纤维化的重要调节因子，维持GSK-3β处于活性状态，尤其是在心肌梗死后的重塑阶段，是抑制纤维化的一种治疗选择，从而限制不良的心肌重塑。目前在临床上，已经提出了靶向GSK-3β家族的药理学抑制剂，可用于特定的疾病，但需警惕此类抑制剂引起的不良纤维化重塑，特别是在心肌梗死后长期使用的情况下。

3.2 心房颤动

心房颤动是临床疾病中常见的心律失常之一。心房纤维化是心房颤动发展和维持的重要病理生理机制。Lv等［23］通过构建大鼠心房颤动模型，miR-27b-3p过表达组心房颤动的发生率明显降低，持续时间缩短，心房纤维化的程度也随之减轻，心房缝隙连接蛋白43（connexin 43，Cx43）表达增加，降低通路相关蛋白Wnt3a以及磷酸化的β-catenin的表达，同时也降低了纤维状胶原蛋白I（collagen I，COL-I）、纤维状胶原蛋白III（collagen III，COL-III）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）等纤维化相关蛋白的表达，从而证实在心房颤动心肌纤维化过程中，miR-27b-3p可以通过靶向Wnt3a调控Wnt/β-catenin信号通路来减轻心肌纤维化。Zhu 等［24］通过体外荧光素酶测定证实，Axin1是miR-124-3p的靶点，在miR-124-3p过表达的CFs中，Axin1的表达减少，而β-catenin、COL-I和α-SMA的表达增加，这些结果表明，miR-124-3p通过Axin1调节Wnt/β-catenin信号通路促进成纤维细胞活化和增殖，从而减轻心房颤动心肌纤维化。Yang等［25］证实了三甲胺N-氧化物（trimethylamine N-oxide，TMAO）促进心房成纤维细胞的增殖和迁移，TMAO还通过激活β-catenin途径促进心房成纤维细胞的表型转化、迁移和胶原分泌，外源性Wnt3a和TMAO协同促进心房成纤维细胞中β-catenin途径的活化和表型转化。

3.3 心力衰竭和心脏肥大

心力衰竭综合征是由于心脏结构、功能、节律或传导异常引起的，其中病理性的心脏肥大与心肌细胞死亡增加和纤维化重塑有关，其特征是收缩和舒张功能降低，常进展为心力衰竭。Yang等［26］采用横主动脉收缩（transverse aortic coarctation，TAC）诱导心力衰竭的小鼠模型，通过检测发现心脏组织中的Wnt1、Wnt3a、活性β-catenin和总β-catenin蛋白的表达升高，并且出现小鼠心脏纤维化，说明Wnt/β-catenin在TAC后的小鼠心脏中被激活，用ICG-001（Wnt通路抑制剂）治疗后降低了TAC诱导的心脏中心肌纤维化及Wnt通路相关蛋白的表达，在原代心肌细胞和CFs的体外模型中也同样观察到这种变化，因此证明了阻断Wnt/β-catenin信号通路能够预防心力衰竭，减轻心肌纤维化，改善心脏损伤。Methatham等［27］同样使用TAC小鼠模型，Masson染色显示TAC小鼠心脏组织中的间质纤维化增加，ICG001处理后明显减少，心脏中β-catenin在TAC小鼠中表达增加，但在ICG001处理的TAC小鼠中被显著抑制，这些实验结果表明，ICG001可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路减少心肌纤维化来预防和改善心脏肥大和心力衰竭。Ahn等［28］发现精氨酸甲基转移酶7（protein arginine methyltransferase 7，PRMT7）基因敲除小鼠会引起心脏肥大和心肌纤维化，而PRMT7缺失的心脏转录组学研究表明，与Wnt信号通路相关的基因表达谱发生了改变，通过机制研究表明，PRMT7通过精氨酸残基93处β-catenin的甲基化来抑制Wnt信号通路，这对于调节β-catenin的活性控制心脏肥大和心肌纤维化至关重要。

3.4 其他心肌纤维化及相关CVD

炎症性扩张型心肌病是一种独特的疾病，在被定义为心肌炎症所导致的心功能障碍。心肌纤维化是扩张型心肌病心功能不全的重要原因，纤维化导致心壁顺应性降低，为了维持心功能，心脏不断扩大，CFs对细胞外基质蛋白的过度沉积在扩张型心肌病的病理过程中起着关键作用［29］。国外学者用分泌的sFRP2沉默细胞外Wnt表达或用Wnt-C59抑制Wnt分泌，阻止TGF-β介导的炎性前体和CFs向致病性肌成纤维细胞的转化；用ICG-001抑制TCF/β-catenin介导的转录或β-catenin的遗传缺失也可以阻止TGF-β诱导的肌成纤维细胞形成；还发现了阻断Smad非依赖性TGF-β激活激酶1（TCF-β-activated kinase 1，TAK1）通路可以完全消除TGF-β诱导的Wnt分泌，同样阻止了CFs的形成；最后在心肌炎患者的心脏标本中Wnt-1/Wnt-5a的水平升高也证实了Wnt轴对于心肌纤维化的关键作用［30］。这表明抑制Wnt分泌或TCF/β-catenin介导的转录可以减轻心肌炎后心肌纤维化的程度，在组织重塑期间Wnt分泌确实对心肌纤维化的发展有着至关重要的作用，由TAK 1介导的Wnt蛋白快速分泌是人和小鼠心肌炎中TGF-β介导的肌成纤维细胞分化和心肌纤维化进展的一种新的下游关键机制。这些结果都充分说明了细胞外Wnt或Wnt/β-catenin的药理学靶向可能是一种有效的治疗方法，可以防止病理性肌成纤维细胞的积聚，使心肌纤维化减轻，这种抗纤维化治疗能防止炎症性心肌病患者的疾病进展。Edyta等［31］使用人CFs模型阐明了TGF-β、Wnt/β-catenin和IL-11之间的相互作用，并提出了一种控制心肌纤维化的新机制，表明Wnt/β-catenin通路的特异性激活促进了TGF-β诱导的CFs到肌成纤维细胞的转变。成纤维细胞和心肌细胞之间的Wnt依赖性相互作用在心脏损伤和修复过程中起着至关重要的作用。表达Wnt1的心外膜细胞在心脏受到损伤后以β-catenin依赖的方式发生上皮细胞间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）以适应成纤维细胞的分化结局［32］。在人类心脏中，心脏内源性抗衰老物质Klotho的丢失，包括调节矿物质代谢在内的多效性作用，促进TGF-β1信号传导，并通过上调Wnt信号传导，导致明显的心肌纤维化［33］。小鼠TAC导致的心脏压力超负荷会激活导致CFs中的Wnt/β-catenin信号通路，导致心肌纤维化，β-catenin是心脏损伤后CFs中ECM基因表达所必需的。在TAC后β-catenin缺失的CFs中，间质纤维化显著减少，保护了心脏功能［34］。在缺乏DVL-1的小鼠中，阻断Wnt信号可以减轻压力超负荷诱导的心肌肥大和间质纤维化的发生［35］。总之，这些研究说明Wnt/β-catenin信号通路通过从心外膜和内皮细胞的分化过渡到间质状态来响应损伤，从而促进心肌纤维化。Nayakanti等［36］发现，Wnt/β-catenin信号通路分子在肺动脉高压患者的右心室和右心室超负荷动物模型中表达上调，Wnt/β-catenin信号通路是通过激活FOS样抗原1（FOS-like antigen1，FOSL1）和FOS样抗原2（FOS-like antigen 2，FOSL2）基因的转录导致右心室的重构，抑制β-catenin、FOSL1/2或WNT3a会使右心室成纤维细胞显著降低胶原合成和其他重塑基因，研究中使用LGKK-974抑制Wnt信号，减轻了纤维化和心肌肥厚，从而改善了肺动脉高压和右心室功能。经历EMT的内皮细胞促进心肌纤维化的发生和发展，CD146是一种在细胞外基质中高度表达的黏附分子，Zhang等发现［37］CD146敲低上调了Wnt通路相关基因，并增加了β-catenin的蛋白质水平和核易位，由此证明了CD146的上调可能对内皮细胞EMT和心肌纤维化起到保护作用。

4 小结与展望

综上所述，抑制Wnt/β-catenin信号通路能够减少心肌纤维化，Wnt/β-catenin信号通路在心肌纤维化中具有关键的调节作用。虽然迄今为止专注于Wnt/β-catenin靶向治疗的临床研究大多局限于癌症方面，但目前的实验研究也能够证明Wnt/β-catenin信号通路在CVD，尤其是心肌纤维化中具有重要作用，因此值得在未来进一步开发Wnt/β-catenin信号通路的靶向药物。希望后续的研究者能够将不同动物模型中的多细胞水平实验策略与更高层次的系统分析相结合，将基础研究的结果转化为临床医学的应用，最终研究出Wnt依赖性的靶向药物治疗人类CVD。