基于Box-Behnken响应面法优选疏肝胃安颗粒制备工艺

柯媛媛，高永跃，罗玉玲，周训蓉*

(1.贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学第二附属医院药学部，贵州 贵阳 550003)

疏肝胃安汤源于贵州中医药大学第二附属医院凌湘力老师25年来的临床经验方。该方主要由柴胡、枳壳、白芍、延胡索、香附等12 味中药组成。具有疏肝理气、和胃止痛的功效，适用于肝胃不和型慢性胃炎[1—2]。疏肝胃安汤在临床上以传统汤剂的形式服用，因汤剂口感差、煎煮时间长、易霉变[3—4]，故考虑制成颗粒剂，相比于汤剂其适用性强，携带储存运输方便[5—6]，更符合现代生活需求。Box-Behnken Design(BBD)响应面法是通过多元二次回归方程拟合各因子与响应值之间的函数相互作用，从而得到预测的最优试验条件。该研究方法试验次数少，应用性强，预测性好[7—8]。本研究通过响应面法拟定试验方案，从响应面中得到各影响因子对指标的影响趋势，筛选出最优的成型工艺条件[9]，为生产提供理论依据，进而推进该方在医院制剂和临床应用的发展。

1 材料与仪器

1.1 材料

中药饮片柴胡、枳壳、白芍、醋香附、延胡索等12 味药均购于贵州同济堂中药饮片有限公司，符合《中国药典》(2020年版)一部各项规定。可溶性淀粉(批号：210401，安徽山河药用辅料股份有限公司)、糊精(批号：2022062301，曲阜市药用辅料有限公司)、胶态二氧化硅(批号：20220103，上海风泓药用辅料技术有限公司)、乳糖(批号：TF46200301，湖南九典宏阳制药有限公司)、甘露醇(批号：GLC22042604，青岛明月海藻集团有限公司)、微晶纤维素(批号：20060904，湖南新绿方药业有限公司)、麦芽糊精(批号：220301，长岭吉隆生物药业有限公司)。

1.2 主要仪器与试剂

HPLC 高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司，型号Agilent1260)、电子天平(沈阳龙腾电子有限公司，型号ESJ182-4)、分析天平(上海菁海仪器有限公司，型号FA2204N)、电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司，型号101-2AB)、水分测定仪(奥豪斯仪器(常州)有限公司，型号MB27ZH)、超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司，型号SK5210HP)、药典筛，纯净水、乙腈(分析纯)。

1.3 方法

1.3.1 柚皮苷含量测定

色谱条件：色谱柱Ultimate plus C18(5 μm，4.6 mm× 250 mm)，流动相为乙腈-0.03%磷酸(20:80)，柱温30 ℃，进样量10 μL，流速1.0 mL·min–1，检测波长283 nm，理论塔板数不低于3000。

取柚皮苷适量，加甲醇制成含量为64.1780 mg·L–1柚皮苷对照品溶液。

于25 mL 容量瓶中，精密加入疏肝胃安水提液1 mL，加50%乙醇定容，摇匀，离心(10000 r·min–1，10 min)，取上层清液，过0.45 μm 滤膜，即得供试品溶液。

1.3.2 提取工艺正交试验设计

取1 倍临床处方量(柴胡6 g、白芍20 g、郁金15 g、香附12 g、枳壳12 g、金钱草12 g、茵陈12 g、黄芩12 g、延胡索12 g、炒麦芽12 g、炒稻芽12 g、甘草3 g)18 份，按照L9(34)正交表煎煮(表1)，过滤，常压浓缩至500 mL 得到相应的供试品溶液。以柚皮苷含量和总固体收率为指标进行综合评价。

表1 提取工艺正交试验因素水平Table 1 Factor levels of orthogonal test for extraction

1.3.3 成型工艺设计

1.3.3.1 颗粒剂制备

称取相应的处方量药材，按最佳提取工艺煎煮、过滤，浓缩至相对密度1.20～1.29 浸膏。加入辅料，混合，制软材。挤压过14 目筛，70～80 ℃烘干。

1.3.3.2 考察指标

(1)成型率 参照《中国药典》(2020 版)四部通则[10]。将颗粒依次过1 号筛和5 号筛，能通过1 号筛但不能通过5 号筛的颗粒为合格颗粒，称重。颗粒成型率(%)=合格颗粒质量/过筛前颗粒质量×100%[11]。

(2)软材系数 观察制粒时软材情况，通过手感黏度、过筛情况以及颗粒完整性进行评价，依项评分(表2)。

表2 感官评价评分Table 2 Sensory evaluation score

(3)休止角 采用固定漏斗法测定休止角。取合格的颗粒，将颗粒体从一定高度的漏斗中自然落到表面皿上[12]，当颗粒全部漏完后，与平面形成的高度即为锥体高度(h)，圆锥的半径即为锥体半径(r)，则颗粒休止角为tanθ=h/r。

(4)吸湿率 取疏肝胃安颗粒2 g，精密称定，将颗粒均匀平铺于称量瓶中，置于干燥器(底部放置饱和硫酸铵溶液)内，密封72 h 后，将其精确称重，求得吸湿率[13]。

颗粒吸湿率(%)=(吸湿后颗粒质量-吸湿前颗粒质量)/吸湿前颗粒质量×100%

(5)水分 取颗粒约2 g，均匀平铺于水分测定仪内部称盘上测量颗粒水分。

1.3.3.3 单因素试验

首先通过单因素实验，考察辅料(可溶性淀粉、糊精、微晶纤维素、甘露醇、乳糖、麦芽糊精等)、辅料配比(1:1、2:1、3:1、4:1)、药辅比(1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.5)、胶态二氧化硅比例(6 %、7 %、8 %、9 %)对成型率、软材情况、制粒情况、颗粒性状的影响。取浸膏8 g，糊精和可溶性淀粉混合辅料，辅料与浸膏比1:1 作为固定条件，初步筛选各因素最适条件[14]。

1.3.3.4 Box-Behnken响应面法设计

基于单因素实验结果，以胶态二氧化硅比例(A)、可溶性淀粉与糊精比例(B)、辅料与浸膏比例(C)为主要影响因素，设计Box-Behnken响应面法实验(表3)。对数值越小越好的指标和数值越大越好的指标分别进行转换，成型率、软材系数的转换公式为(该值–最小值)/(最大值–最小值)，水分、吸湿性、休止角的转换公式为(最大值–该值)/(最大值–最小值)[15]。对转换的数值采用综合加权计算总评得分，总评分=软材系数× 0.4 + 成型率× 0.3 + 休止角×0.1 + 水分× 0.1 + 吸湿率× 0.1。不同条件下所得总评值越大，表明制备工艺越优。

表3 响应面设计因素与水平Table 3 Response surface design factors and levels

2 结果与分析

2.1 提取工艺正交试验结果

正交试验结果表明，三个因素对柚皮苷含量和总固体收率的综合得分均有不同程度的影响，其影响大小为提取次数C > 加水倍数A > 提取时间 B，根据综合评分得出最优组合为A3B2C3(表4)。方差分析显示，A、B 两因素无显著差异，结合实际情况，在大生产模式下，药材批量大，设备容器大，煎煮30 min 提取不完全，本着绿色经济和节约成本的原则，最终以A1B2C3为最佳提取条件。

表4 L9(34)正交实验设计及结果Table 4 L9(34)orthogonal experimental design table and results

2.2 最佳提取工艺验证

平行称取1 倍处方量3 份，按照最佳水提条件A1B2C3进行验证，测定柚皮苷含量和总固体收率，得出柚皮苷平均含量为1.91 mg·L–1，总固体收率平均值为21.6%，二者RSD 值均小于5%，与正交试验结果相近，表明该提取工艺条件稳定可行。

2.3 成型工艺条件

2.3.1 单因素对成型颗粒性状的影响

单因素实验结果表明，选用单一辅料进行制粒时，所需辅料量大，达浸膏量的2～3 倍，导致日服用量增加。乳糖、微晶纤维素、甘露醇易黏筛网，成型率较低，麦芽糊精软材过硬，不易过筛，成型率最小(表5)。故以淀粉和糊精混合辅料为宜。

表5 辅料及其比例对制粒的影响Table 5 Effects of excipients and their proportion on granulation

辅料比例对制粒成型、颗粒完整性等有较大影响(表5)。随着糊精占比增加，软材逐渐变硬，成型率降低，难以过筛。当辅料比(糊精：可溶性淀粉)为1:1、2:1 时，软材略黏，成型率在90%以上，当比例为1:1 时颗粒细粉较少，颗粒整体更均匀。

随着辅料与浸膏比例增加，成型率先增加后下降，软材逐渐变黏，过筛困难，成型率降低。当辅料与浸膏比例为1:1 时，软材略黏，颗粒均匀，成型率高(表6)。

表6 药辅比例对制粒的影响Table 6 Effects of drug-assisted ratio on granulation

由表7 可以看出，随着胶态二氧化硅比例逐渐增加，成型率先升后降，当比例为8%时，成型率最高，软材适中，颗粒性状完整。

表7 二氧化硅比例对制粒的影响Table 7 Effects of silica ratio on granulation

2.3.2 响应面法筛选最佳成型工艺

采用Box-Behnken响应面法拟定试验，实验设计与结果见表8。运用软件Design-Expert.V8.0.6.1对影响因素进行拟合分析，总评值(Y)为拟合因变量，得到二次多项式回归方程为Y=0.70+0.027A–8.125×10–3B+0.17C–0.064AB+0.051AC–0.025BC–0.014A2–0.044B2–0.16C2。通过方程分析可以得出，该模型拟合度良好(表9)。 因素C、C2、B2、AB、AC 对总评值影响显著，交互项BC 影响不显著，辅料和浸膏比例对总评值影响较大。

表8 响应面法实验设计与结果Table 8 Experimental design and results

表9 响应面方差分析Table 9 Response surface analysis of variance

采用Design-Expert.V8.0.6.1 软件对试验结果进行分析，得到总评值与胶态二氧化硅用量、辅料比例、辅料与浸膏比例交互作用的三维响应面图和等高线图(图1～图4)。由此可得疏肝胃安颗粒最佳成型工艺为：胶态二氧化硅比例(A)为8 %、可溶性淀粉与糊精比例(B)为1:1、辅料与浸膏比例(C)为1:1。

图1 可溶性淀粉与糊精比例与胶态二氧化硅比例对总评影响3D 图Fig.1 3D diagram of the effect of the ratio of soluble starch to dextrin and colloidal silica on the overall evaluation

图 2 辅料与浸膏比与胶态二氧化硅比例对总评影响3D 图Fig.2 The effect of the ratio of excipients to extract to colloidal silica on the overall evaluation 3D

图3 辅料与浸膏比与可溶性淀粉与糊精比例对总评影响3D 图Fig.3 3D diagram of the effect of excipients to extractratio and soluble starch to dextrin ratio on the overall evaluation

图4 可溶性淀粉与糊精比例与胶态二氧化硅比例对总评等高线图Fig.4 Overall contour plot of the ratio of soluble starch to dextrin versus the ratio of colloidal silica

2.3.3 最佳成型工艺条件验证

平行称取3 份同批次浸膏，按优化制粒工艺制备3 批疏肝胃安颗粒。取合格颗粒，代入方程计算，求得总评值平均为0.737(表10)，与模型拟合方程理论预测值0.766，两者偏差1.93%(小于5%)，表明该方案合理、可行、稳定，有利于工艺生产参数的优化。

表10 优化成型工艺验证结果Table 10 Three batches of verification test results

3 讨论

疏肝胃安方是由柴胡、白芍、枳壳、延胡索、香附等12 味中药组成。药理研究表明，柴胡、白芍具消炎、镇痛、保护和修复胃黏膜屏障功能[16]；枳壳的挥发油和柠檬烯均能促进胃肠蠕动[17—18]；香附所含挥发油能诱导细胞凋亡而起到显著的抑菌作用且具有促进胃肠蠕动作用[19—20]；延胡索具有镇痛、抗胃溃疡等药理作用[21]。不管是单方药还是配方药，对胃炎和溃疡都发挥着重要的治疗作用。

本实验对疏肝胃安颗粒的制备工艺进行系统研究，通过正交试验，以柚皮苷含量和总固体收率为综合指标，选出最佳的水提工艺条件。在颗粒成型工艺单因素考察中，由于中药浸膏中含有蛋白质、糖类、鞣制等成分，使得浸膏黏度增加，单味辅料虽能制成符合规定的颗粒，但过筛困难，易黏筛网，颗粒硬度较大，溶化性差，且日服用量大，导致患者顺应性差，故考虑采用糊精淀粉为混合辅料改善软材和制粒情况，在此基础上加入胶态二氧化硅，能大大缩减辅料用量。单因素实验初步确定了辅料的种类和比例范围，再通过响应面法得到的3D 立体图和等高线图，以及对前期相关的数据进行方差分析、模型诊断，精准筛选出该方颗粒最佳制备工艺参数。验证结果表明，该制备工艺稳定可靠，软材好，成型率高，流动性好，吸湿率低，辅料价格低廉。响应面法是筛选工艺条件、降低成本、提升和优化产品质量以及解决问题的一种经济有效的方法[22]，能对影响因素进行快速且有效的优化，提高实验的准确性与可信度[23]，在疏肝胃安颗粒成型工艺筛选的应用中具有可行性和合理性[24]。