铁甲秋海棠花粉离体萌发研究

吕燕玲

(厦门市园林植物园，福建 厦门 361003)

花期不遇、花粉活力差等问题常导致杂交失败，是杂交育种的主要难题[1]。花粉作为杂交育种的重要材料，其活性是杂交育种成功的关键因素之一，以花粉活力较高的种类作为亲本，可提高杂交成功率。花粉离体保存是解决杂交中花期不遇的有效途径，但保存的花粉能否保持活力，则需要通过测定花粉活性来判断。花粉离体培养法是目前检测花粉活性、育性的最佳方法[2]。在离体培养基中需添加蔗糖、硼酸、聚乙二醇(PEG)、钙离子等成分。但由于植物种类不同，最适合其花粉萌发的培养基成分及浓度也存在差异[2—3]。

铁甲秋海棠Begoniamasoniana是秋海棠科秋海棠属植物，在中国广西和越南北部均有分布，主要生于石灰岩石上或林下潮湿处[4]。其叶片斑纹奇特[5]，是优良的景观植物[6]。有关铁甲秋海棠的研究，主要集中在扦插繁殖[7]、组培快繁[8]、斑叶形成原因[9]等方面。未见铁甲秋海棠花粉离体培养方面的相关报道。关于本属其他种类秋海棠的花粉离体培养及花粉活力测定的报道也较少[10—14]。为此，本研究以铁甲秋海棠花粉为材料，探讨其花粉离体萌发及花粉管生长的基本培养基条件，以期为铁甲秋海棠及同属其他秋海棠的花粉研究和杂交育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为铁甲秋海棠花粉，供试植株种植于厦门市园林植物园引种驯化区保育温室内。于晴天上午9:00～10:00，选取生长健壮、长势良好的植株，采集开放1～2 d 的铁甲秋海棠花朵，取雄蕊置于25～26 ℃烘箱3～3.5 h，烘干至花粉刚刚散出为宜。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

试验设计采用单因素分析，对铁甲秋海棠花粉液体培养基组分蔗糖、硼酸、PEG-4000、氯化钙进行筛选。先以0.003%硼酸、3% PEG-4000、0.003%氯化钙为固定培养液条件，然后依次按蔗糖、硼酸、PEG-4000、氯化钙分别探究各组分不同浓度对铁甲秋海棠花粉离体萌发的影响，培养基各组分浓度(质量分数)梯度设置如表1。

表1 基本培养基中各组分添加量Table 1 The amount of each component added in the basic medium

观察最佳培养基中铁甲秋海棠花粉在不同培养时间下的萌发情况。培养时间设置为30、60、90、120、140 min。

1.2.2 培养方法

参考周瑾等[2]、杨延红等[15]的方法并加以改进，取50 μL 培养液，置于载玻片凹槽处，用镊子夹取少量花粉，将其抖落在培养基上，用干净的牙签搅动至花粉均匀分布在培养基表面。将制好的载玻片放置于铺有双层湿润滤纸的培养皿中并加盖培养，于25 ℃人工气候箱中暗培养0～140 min，每处理重复3 次。

1.2.3 数据分析

利用Axiolab 5 正置显微镜，观察、测量、拍照保存，并根据图片统计花粉萌发率。每处理选取5个视野进行观察，每处理3 次重复。每个视野中花粉粒数量大于100 粒，花粉管长度大于花粉粒直径则记为已萌发[2]。每个视野随机选取20 个花粉管测量长度。

利用 SPSS 18.0 软件进行数据统计分析，采用单因素方差分析法及Dunnett’s 进行数据差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 培养基筛选

2.1.1 蔗糖浓度对铁甲秋海棠花粉离体萌发的影响

由表2 可知，蔗糖浓度对铁甲秋海棠花粉萌发和花粉管的生长影响显著。当蔗糖浓度为5%时，花粉萌发率最高78.69%，此时，花粉管长度也最长，为491.22 μm；当浓度高于10%时，花粉萌发率下降至66.15%，花粉管生长也受到明显抑制，仅为313.3 μm；当蔗糖浓度增加到15%时，抑制效果最明显，花粉无法正常萌发和生长。因此，铁甲秋海棠花粉萌发最佳蔗糖浓度为5%，浓度过高或过低，均会抑制铁甲秋海棠的花粉萌发。

表2 蔗糖浓度对铁甲秋海棠花粉萌发的影响Table 2 Effect of sucrose concentration on pollen germination of Begonia masoniana

2.1.2 硼酸浓度对铁甲秋海棠花粉离体培养的影响

由表3 可知，在一定范围内，铁甲秋海棠花粉的萌发率随硼酸浓度(0.000～0.010%)增加而升高。不同硼酸浓度条件下的铁甲秋海棠花粉萌发率差异显著。当硼酸浓度为0.010%时，花粉萌发率可达85.24%，硼酸浓度为0.015%时，花粉萌发受抑制；随着硼酸浓度继续升高，差异更加显著。当硼酸浓度为0.010%时，花粉管长度达最大值509.79 μm；硼酸浓度为0.005%与0.010%时，花粉管长度差异不显著；当硼酸浓度达0.015%时，花粉管生长受到一定程度抑制；当硼酸浓度超过0.020%时，花粉管生长状态不良，部分花粉管呈波浪形。综上，适合铁甲秋海棠花粉萌发的硼酸浓度为0.010%。

表3 硼酸浓度对铁甲秋海棠花粉萌发的影响Table 3 Effect of boric acid concentration on pollen germination of Begonia masoniana

2.1.3 PEG-4000 浓度对铁甲秋海棠花粉萌发的影响

由表4 可知，PEG-4000 对铁甲秋海棠花粉萌发和花粉管生长的影响总体趋势与蔗糖一致，各浓度间差异显著。在一定范围内，铁甲秋海棠花粉的萌发率及花粉管长度随PEG-4000 浓度升高而增加。当PEG-4000 浓度为5%时，花粉萌发率最高，可达89.79%，此时，花粉管长度也达最大值506.86 μm。当浓度高于10%时，花粉萌发和花粉管生长受抑制，当浓度增至20%时，抑制效果最明显。因此，铁甲秋海棠花粉萌发最佳 PEG-4000 浓度为 5%。PEG-4000 浓度过高或过低对铁甲秋海棠花粉萌发均不利。

表4 PEG-4000 浓度对铁甲秋海棠花粉萌发的影响Table 4 Effect of PEG-4000 concentration on pollen germination of Begonia masoniana

2.1.4 氯化钙浓度对铁甲秋海棠花粉萌发的影响

由表5 可知，当氯化钙浓度为0.003%时，花粉萌发率最高，达89.95%，显著高于对照；但氯化钙浓度为0.003%～0.010%时，花粉萌发率差异不显著。因此，氯化钙浓度在0.003%～0.010%范围内可促进铁甲秋海棠花粉萌发。当氯化钙浓度达0.020%时，花粉萌发受抑制；当浓度为0.040%时，抑制效果更加显著。随着氯化钙浓度的增加，铁甲秋海棠花粉管长度的变化呈先升高后下降的趋势。当浓度为0.003%时，花粉管长度最长，达508.76 μm；当浓度增至0.005%时，花粉管生长开始受抑制。综上，铁甲秋海棠花粉萌发和花粉管生长的最佳氯化钙浓度为0.003%。

表5 氯化钙浓度对铁甲秋海棠花粉萌发的影响Table 5 Effect of calcium concentration on pollen germination of Begonia masoniana

2.2 培养时间

由2.1 筛选出铁甲秋海棠花粉萌发的最适培养基为5%蔗糖+ 0.010%硼酸+ 5% PEG-4000+ 0.003%氯化钙，在此条件下培养30 min，花粉开始萌动(此时花粉管长度小于花粉粒直径，视为不萌发)；培养60 min 少量萌发；培养90 min 超过50%花粉萌发，花粉管显著伸长；培养120 min 萌发率基本趋于稳定，此时花粉管生长状态良好，花粉萌发率达90.86%，花粉管长度达511.51 μm；培养140 min 花粉萌发率不再升高，花粉管继续生长，达538.89 μm(表6、图1)。因此，铁甲秋海棠花粉离体培养的最佳时间为120 min，超过120 min 花粉萌发率变化不明显，且花粉管长度太长，不利于观察统计。

图1 铁甲秋海棠花粉不同培养时间的萌发情况Fig. 1 Pollen germination of Begonia masoniana at different culture time

表6 培养时间对铁甲秋海棠花粉萌发的影响Table 6 Effect of culture time on pollen germination of Begonia masoniana

3 讨论

蔗糖不仅是花粉粒萌发的主要营养来源，还可在花粉萌发过程中调节花粉细胞渗透压[15]。研究表明，当培养基蔗糖浓度过低时，花粉细胞吸胀并使花粉壁破裂，内容物析出，花粉失活；而当外界环境渗透压过高时，花粉细胞产生质壁分离现象，花粉萌发同样会受到抑制[16]。本研究显示，15%蔗糖处理铁甲秋海棠花粉无法正常萌发，可能是由于蔗糖浓度太高而导致花粉细胞失水死亡，萌发率为零[3,17]。铁甲秋海棠花粉萌发的最适蔗糖浓度为5%，这与黄山玉兰Yulaniacylindrica、大丽花Dahliapinnata花粉萌发所需的蔗糖浓度基本一致[18—19]。

研究表明，硼对花粉萌发和花粉管生长有促进作用，其对花粉管的生长作用可能是由于：一方面，硼可以促进糖-硼酸盐复合物的形成以及增加氧的吸收；另一方面，由于硼是合成花粉管所必需的细胞壁的果胶成分[15，20]。大部分的硼存在于细胞壁中，会与果胶类物质结合，使酸性果胶变成酯化果胶[21]。酸性果胶使细胞壁有足够的机械强度，遍布于整个花粉管，而集中在花粉管顶端的酯化果胶则会促进花粉管的延伸；从而促进花粉管生长[21]。因此，添加适量的硼有利于花粉萌发。在胡迎峰等[18]的研究中，黄山玉兰花粉萌发的最佳硼浓度是0.01%，这与本研究结果一致。

作为高分子渗透剂，PEG 可通过提高细胞膜透性及柔软度，促进细胞对糖的吸收[2,22]。段青等[19]研究发现，2.5% PEG-4000 最适合大丽花花粉萌发。陈奇等[23]认为5% PEG-6000 最适合白菜型油菜Brassicarapa花粉离体萌发。而杨延红等[24]也认为最适合‘红宝石’海棠Malusspetabilis‘Royalty’花粉的萌发和花粉管生长的PEG-6000 浓度为5%。铁甲秋海棠花粉萌发的最适PEG-4000 浓度亦为5%，与前人研究结果基本一致。

钙离子作为植物代谢的重要调控因子，通常累积在花粉管尖端，其含量的波动对引导花粉萌发及花粉管生长有重要作用[3,15]。当内源钙离子不足时，添加一定浓度的外源钙离子可以促进花粉萌发，但当内源钙离子充足时，高浓度外源钙离子反而会抑制花粉萌发[15]。与之类似，低浓度(0.003%～0.010%)氯化钙可促进铁甲秋海棠的花粉萌发。铁甲秋海棠花粉管生长的最佳氯化钙浓度为0.003%；当浓度达0.005%时，花粉管生长受到抑制。值得注意的是，在未添加钙离子的处理中，铁甲秋海棠的萌发率高于其他物种花粉萌发率，达85.57%，花粉管长度达407.04 μm，这与前人的研究存在差异[15]。

不同植物花粉离体培养的最佳观察时间存在差异。连翘Forsythiasuspensa花粉萌发的最佳观察时间为培养3 h[15]；野杏Armeniacavulgarisvar.ansu花粉萌发最佳观察时间为培养6 h[25]。铁甲秋海棠花粉开始萌动时间为培养30 min；培养120 min 时，萌发率最高，状态最佳；当培养140 min 时，花粉管长度偏长，会导致花粉在培养基中聚集成团，不易分散，从而影响观测效果。因此，铁甲秋海棠花粉离体培养最佳观察时间为120 min。

综上所述，铁甲秋海棠花粉离体萌发适宜培养基为5%蔗糖+ 0.01%硼酸+ 5% PEG+ 0.003%氯化钙，最佳观察时间为培养120 min。