非洲猪瘟疫苗研究现状

金贵兵 杨 丁 金仕强 邹仲航 牟燕平 古从伟 杨 倩*

(1 宜宾市叙州区动物疫病预防控制中心，四川宜宾 644600；2 宜宾市动物疫病预防控制中心，四川宜宾 644000；3 西南医科大学实验动物中心，四川泸州 646000；）

1921年，非洲猪瘟病毒（ASFV）首次在肯尼亚被报道，随后经西欧、东欧传入东亚。2018年，非洲猪瘟病毒蔓延到我国，给我国生猪养殖业造成了不可估量的损失[1]。从发现至今，非洲猪瘟已有上百年的流行历史，为了根除该病毒，人们采用了诸如生物防控、扑杀、隔离等策略，虽然取得了阶段性的成功，但在缺乏非洲猪瘟病毒商业化疫苗的情况下，还是难以控制其蔓延和反复发生[2]。疫苗接种一直被认为是控制传染性疾病最有效的方法，通过疫苗接种得到彻底根除的传染病有天花、牛瘟等[3]。20世纪我国研制的脊髓灰质炎“糖丸”口服减毒活疫苗，就成功控制和消灭了脊髓灰质炎在我国的流行[4,5]。

自20世纪60年代以来，全世界范围就开始了非洲猪瘟病毒疫苗的开发与研究，但研究成果一般都处于实验室阶段，距离实际应用还有一定差距。导致非洲猪瘟病毒疫苗开发滞后的主要因素在于非洲猪瘟病毒复杂的基因组结构和多变的基因型。非洲猪瘟病毒基因组是一个线性且共价封闭的双链DNA 分子，长度在170～190 kbp 之间，可编码大量的蛋白质参与逃避宿主的防御系统[6]。而且非洲猪瘟病毒基因组结构也不够稳定，常因病毒间的基因重组和基因突变发生遗传改变[7]，这无疑加大了非洲猪瘟病毒疫苗的研究难度。截至目前，根据B646L（p72）基因末端的核苷酸差异，已鉴定出24 种非洲猪瘟病毒的基因型[8]。这24 种基因型在非洲均有流行报道，且主要分布在东非和南非。目前大多数试验阶段研究的非洲猪瘟病毒疫苗主要针对基因Ⅰ型（欧洲）和基因Ⅱ型（亚洲）流行毒株。从部分研究结果来看，多种疫苗仅对同源毒株感染具有保护作用，因此，不太可能针对其他系统发育差异较大的毒株提供交叉保护，这也阻碍了疫苗的进一步开发与利用。此外，疫苗开发通常还受到接种策略、抗原免疫原性、毒株类型、免疫剂量、攻毒剂量、接种动物个体差异、接种途径等多种因素影响。因此，非洲猪瘟病毒疫苗的开发还需要大量的研究来解决以上各种问题。

虽然现在的研究已证实多种类型的疫苗可以对感染非洲猪瘟病毒后提供强保护，但对其保护性免疫的了解和定义还十分有限。本文对现有不同类型的非洲猪瘟病毒疫苗研究现状进行初步的概述，以期更好地了解该病毒，为非洲猪瘟的预防、控制和根除提供参考。

1 非洲猪瘟病毒灭活疫苗

一直以来，灭活疫苗都是一种较为安全、廉价且成熟的疫苗。因为在灭活过程中，各类物理或化学作用有效消除了病毒向毒性表型的逆转，使病毒不再具备潜在传染能力。虽然灭活疫苗具有较高的安全性，但过去的研究表示，针对非洲猪瘟病毒的灭活疫苗无法提供很好的免疫保护，即使联合了刺激细胞免疫的佐剂[9]。非洲猪瘟病毒灭活疫苗虽然在某些情况下能够诱导体液免疫反应，但产生的抗体在感染中很难实现有效的病毒中和[10]，而且非洲猪瘟病毒灭活疫苗通常不会引发完整的细胞免疫反应。因此，灭活疫苗可能不是开发有效非洲猪瘟病毒疫苗的可行策略。

2 非洲猪瘟病毒亚单位疫苗

亚单位疫苗是一类不含有核酸的重组蛋白或合成肽疫苗，这些蛋白和肽类通常是能够诱导保护性免疫反应的特定病毒表位。此类疫苗的关键是筛选能够诱导产生中和抗体的抗原或抗原表位[10]，旨在诱导中和血清学反应。非洲猪瘟病毒编码多达170 多种蛋白质，其中包括结构蛋白和宿主免疫调节蛋白，因此，在筛选免疫性较好的抗原蛋白上存在一定难度。目前已经评估了几种非洲猪瘟病毒抗原的保护潜力，包括结构蛋白p54、p30、p72 和血凝素CD2v 等。第一个被证明对非洲猪瘟病毒攻击具有保护作用的重组病毒蛋白是杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒血凝素（HA）蛋白--CD2v，其产生的中和抗体能抑制病毒对宿主血细胞的吸附和单核细胞的侵染，可部分抵御同源毒株的感染[11,12]。p54、p30 和p72是非洲猪瘟病毒的结构蛋白，均能够诱导机体产生中和抗体，其中针对p72 和p54 的抗体可以阻断非洲猪瘟病毒的吸附，针对p30 的抗体可以阻断病毒的内化[13]。杆状病毒中表达的重组p54 和p30 蛋白单独使用时，不能保护免疫猪免受非洲猪瘟病毒的攻击，然而二者同时使用能让50%的免疫猪抵御非洲猪瘟病毒强毒株E75 的致死性攻击，而且病毒血症症状出现的时间延迟，症状也有所减轻[14]。此外，用杆状病毒表达的p54/p30 融合蛋白进行免疫，也减轻了非洲猪瘟病毒血症症状，并保护接受免疫的猪免受E75 的攻击[15]。

Neilan 等[16]采用杆状病毒表达的p54、p30、p72 和p22 蛋白组合免疫猪时，尽管检测到高滴度的ASFV 特异性中和抗体，但却不能抵御毒株Pretoriuskop/96/4（Pr4）的攻击，说明在非洲猪瘟病毒感染中，抗体介导的免疫反应似乎不能提供足够的免疫保护。Oura 等[17]的研究证明细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）介导的细胞免疫反应在抵御非洲猪瘟病毒感染方面发挥着至关重要的作用，表明除了中和抗体外，还需要能够刺激CTL 的疫苗来抵御非洲猪瘟病毒的感染。

3 非洲猪瘟病毒核酸疫苗

核酸疫苗免疫主要是将DNA 或信使RNA（mRNA）序列递送进宿主细胞内生成抗原蛋白，模拟疾病抗原刺激免疫应答。核酸疫苗可产生具有翻译后修饰天然构象的内源性蛋白，并通过MHC Ⅰ类和Ⅱ类复合物进行抗原递呈，从而激活CD8＋T 和CD4＋T 细胞。因此，与基于抗原蛋白的亚单位疫苗相比，核酸疫苗能够诱导CTL免疫反应。

2011年，Argilaguet 等[18]构建了表达p54/p30 融合蛋白的质粒DNA（pCMV-PQ），pCMV-PQ 不能在猪体内诱导可检测的免疫反应，但在小鼠体内可以。为了改善这一状况，他们将编码猪白细胞抗原Ⅱ的特异性抗体单链可变区与pCMV-PQ 融合构建pCMV-APCH1PQ。然而，pCMV-APCH1PQ 虽然诱导了广泛的免疫应答，但却对非洲猪瘟病毒的攻击无效，而且还加重免疫猪的病毒血症症状。2012年，Argilaguet 等[19]又构建了表达CD2v/p54/p30 融合蛋白的质粒DNA（pCMV-sHAPQ），发现pCMV-sHAPQ 能够在体内诱导特异性的B 细胞和T 细胞反应，但无法提供免疫保护。此后，继续在pCMV-sHAPQ 质粒的基础上融合泛素蛋白，构建了pCMV-UbsHAPQ 质粒，用于靶向体内Ⅰ类抗原呈递。pCMV-UbsHAPQ 诱导了强烈的CTL 反应，在缺乏特异性抗体的情况下，为超过50%的免疫猪提供了保护，文章作者推测这种保护作用与血液中大量CD2v 特异性CD8+T 细胞相关。

为了筛选更多参与ASFV 保护性免疫的T 细胞靶点抗原，2014年，Lacasta 等[20]基于ASFV 毒株Ba71v，构建了与泛素融合的DNA 表达文库（ASFVUblib），ASFVUblib 激发了大量ASFV 特异性CD8＋T 细胞，CD8＋T 细胞在缺乏特异性抗体的情况下，保护了60%的免疫猪免受毒株E75 的致命攻击。该研究进一步支持了CTL 细胞反应在抗非洲猪瘟病毒中的重要性，同时揭示了多种具有潜在诱导T 细胞反应能力的非洲猪瘟病毒抗原的存在。因此，在随后的研究中，该实验室研究者们继续筛选和鉴定不同基因型非洲猪瘟病毒的T 细胞靶点抗原[21,22]。

4 非洲猪瘟病毒重组病毒载体疫苗

除了核酸疫苗，病毒载体疫苗也能诱导体液免疫和细胞免疫。通过将目标病毒的免疫原基因导入载体病毒基因组中实现。此外，病毒载体疫苗可以很好地区分感染动物和接种动物（DIVA），即病毒载体疫苗自身编码的免疫原可作为疫苗标记。

2013年，Argilaguet 等[23]在BacMam 载体（一种基于杆状病毒的载体，具有转染哺乳动物细胞表达靶基因的能力）上导入非洲猪瘟病毒的CD2v/p54/p30 融合基因构建了BacMam-sHAPQ 病毒载体疫苗，Bac-Mam-sHAPQ 可保护2/3 的猪免受同源亚致死性毒株的攻击，免疫猪的血清中没有检测到特异性抗体，保护作用可能与病毒特异性T 细胞反应相关。

通过“鸡尾酒”免疫方式，人们评估了病毒载体递送的多种非洲猪瘟病毒抗原的免疫原性。其中，腺病毒载体递送的非洲猪瘟病毒抗原混合物（p32、p54、pp62 和p72 抗原，以及A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR、B438L、K205R 和A104R 抗原），均诱导了特异性抗体和细胞免疫反应[24,25]。改良安卡拉痘病毒载体（MVA）递送的p72、CD2v 和C- 型凝集素抗原虽然没有诱导特异性抗体产生，但却检测到特异性T细胞反应[26]。随后Lokhandwala 等[27]将上述非洲猪瘟病毒腺病毒载体疫苗重新组合，测试了其攻毒后的保护效果。在与佐剂BioMize 的组合免疫下，不仅没有提高免疫保护率，还出现了疾病加重的现象。而与佐剂ZTS-01 组合免疫有较好的存活率，但没有很好控制临床症状。总之，没有一种抗原产生了具有统计学意义的保护作用。

为了增强免疫保护效果，研究者们又采用了初次免疫和加强免疫的接种策略。Goatley 等[28]克隆了OURT88/3 毒株的B602L、p72、p30、p54、E199L、EP153R、F317L 和MGF505-5R 基因，导入腺病毒载体后进行初次免疫，随后又将以上抗原基因导入MVA载体进行加强免疫，最后获得100%的同源攻毒保护。

5 非洲猪瘟病毒减毒活疫苗

减毒活疫苗（live-attenuated vaccines,LAVs）大致可分为天然减毒活疫苗、传统人工减毒活疫苗和人工基因缺失减毒活疫苗。相比于亚单位疫苗和核酸疫苗只能提供部分同源保护，非洲猪瘟病毒减毒活疫苗可以提供完全同源和部分异源感染保护[29]。

5.1 天然减毒活疫苗

天然减毒活疫苗是从自然界中分离到的毒性降低或无红细胞吸附（non-HAD）能力的自然减毒毒株。NH/P68 和OURT88/3 是非洲猪瘟病毒的2 个天然弱毒株，由葡萄牙科学家分离得到，属于non-HAD 基因Ⅰ型。早期的研究发现，NH/P68 接种猪主要表现为非洲猪瘟慢性病变或是无症状反应，且这些无症状的免疫猪能100%抵抗毒株L60 和Arm07 的攻击[30]，期间所产生的免疫保护与NK 细胞的活性呈正相关[31]。King 等[32]用OURT88/3 对欧洲家猪进行初次免疫，随后用同基因型的OURT88/1 加强免疫，发现85.7%和100%的免疫猪可以免受非洲株Benin 97/1 和Uganda 1965 的攻击，其中分别有超过78%和50%的猪，在受到Benin 97/1和Uganda 1965 攻击时，没有表现出任何病毒血症的迹象。Mulumba 等[33]用OURT88/3 弱毒株免疫猪后，50%的免疫猪可以抵御OURT88/1（基因型Ⅰ）的攻击，而且存活下来的免疫猪还能继续抵御DRC085/10（基因型Ⅰ）的攻击。随后，又有研究者比较了不同剂量和不同接种途径接种OURT88/3 后的保护情况，结果发现鼻内接种（100%）比肌肉注射（50%～66%）显示出更高的保护率[34]。

2017年，人们在拉脱维亚的野猪身上又分离到1 株non-HAD 基因Ⅱ型ASFV 天然弱毒株，命名为Lv17/WB/Rie1[35]。在对抗强毒株Arm07 的致死性感染时，Lv17/WB/Rie1 对野猪的口服免疫保护率达到了92%[36]。2021年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所报道了国内non-HAD 低致死率自然变异株，虽然毒力明显降低，但仍然具有很强的水平传播能力[37]。总的来说，天然弱毒株不太可能直接作为LAVs 使用，由于残余毒力，部分猪在一定剂量下接种弱毒株后会出现副反应。通过基因重组技术进一步删除弱毒株的相关毒力基因可能会提高其作为LAVs 的安全性。

5.2 传统人工减毒活疫苗

传统人工减毒活疫苗是病毒在体外细胞系或通过非宿主动物连续传代而形成的。20世纪60年代，研究者们就通过细胞传代的方式进行了ASF 减毒活疫苗的研制。早期的这些研究已经证实非洲猪瘟病毒可以在猪骨髓细胞、Vero 细胞、猪肾细胞（PK-2a）等传代细胞系上繁殖，而且连续传代后的毒株接种猪时，临床症状大大减轻并能不同程度抵御强毒株的攻击[38]。1960年，西班牙和葡萄牙大范围使用非洲猪瘟病毒弱毒活疫苗（猪骨髓细胞上连续传代所得）进行田间试验，结果导致了免疫失败事件，动物出现肺炎、流产和死亡等不良反应[39]。这也表明非洲猪瘟病毒细胞传代致弱毒株虽然是疫苗研究的一个重要方向，但是依然存在很多不确定性，其安全性和有效性还很难得到保障。

通过一系列研究发现，增加传代次数虽然降低了病毒毒力，但也容易导致病毒的免疫原性降低，而且受不同毒株和细胞系的影响，也很难摸索到合适的传代次数进行后续的动物免疫试验，因而非洲猪瘟病毒细胞传代致弱毒株的研制具有一定的盲目性和随机性，很难预判其攻毒后的免疫保护效果。2015年，Krug 等[40]将非洲猪瘟病毒格鲁吉亚株（ASFV-G）在Vero 细胞中连续传代110 次，发现毒力完全消失，接种家猪后无任何临床反应，但攻毒后却发现没有任何免疫保护作用。同样，Balysheva 等[41]将Stavropol 01/08 强毒株分别在A4C2细胞、CV 细胞和猪肾细胞（PSGK-60）上连续传代，结果发现A4C2 细胞的第14 代毒和PSGK-60 细胞的第20 代毒毒力依然很强，接种猪全部死亡。A4C2 细胞的第24/33 代毒和CV 细胞的第20 代毒毒力明细减弱，接种猪全部存活，但接种后的猪无法抵御强毒株的攻击。

比起疫苗研制，细胞传代致弱毒株在基因组功能和致病机理研究等方面发挥了更大的作用。Krug 等[40]通过对ASFV-G 细胞传代致弱毒株突变基因区域进行分析，发现ASFV-G 在Vero 细胞上连续传60 代后，其I177L基因第42 位脯氨酸变成丝氨酸。传至110 代时，M1249L 基因第471 位的Arg 变成Gln，CP2475L 基因第200 位的Glu 变成Gly。这不仅能很好地了解突变基因与病毒毒力和免疫原性的相关性，对基因缺失减毒活疫苗的研制也更具有指导意义。

5.3 人工基因缺失减毒活疫苗

人工基因缺失减毒活疫苗是通过敲除病毒的某些毒力基因而形成的。早期研究较多的与非洲猪瘟病毒毒力和感染宿主范围相关基因有TK、MGF505、MGF360、CD2v（EP402R）、9GL（B119L）、NL（DP71L）等[42]。在这些基因中，TK 和9GL 可以通过调控宿主的蛋白去磷酸化酶1α 来阻止宿主细胞蛋白合成的关闭，TK 和9GL 基因缺失的非洲猪瘟病毒在猪巨噬细胞中无法正常复制[43,44]。MGF505/360 基因能抑制宿主I 型IFN 应答，该类基因的缺失不仅会降低非洲猪瘟病毒的毒力，还能抑制其体外复制[45]。敲除这些基因不仅可以降低非洲猪瘟病毒的致病性，还能诱导针对同源非洲猪瘟病毒感染的保护性反应[46,48]。

除了诱导同源保护外，非洲猪瘟病毒基因缺失减毒活疫苗还具有良好的免疫交叉保护。缺失CD2v 基因的非洲猪瘟病毒毒株BA71ΔCD2，不仅对亲本株BA71 的致命攻击具有保护作用，而且对异源毒株E75（基因Ⅰ型）和Georgia 2007/1（基因Ⅱ型）也具有100%保护作用，且大部分猪没有表现出非洲猪瘟病毒感染症状，这也是基因缺失减毒活疫苗抵抗异源非洲猪瘟病毒毒株的首次报道[49]。在随后的扩展研究中，Lopez 等[50]继续深入探究了BA71ΔCD2 的交叉免疫保护，采用106PFU 剂量的 BA71ΔCD2 免疫猪后，用毒株RSA/11/2017（基因XIX 型）和Ken06.Bus（基因Ⅸ型）进行攻击，分别有83.3%和33.3%的免疫猪存活。BA71ΔCD2 的加强免疫可以使抗Ken06.Bus 的保护率提高至50%，存活下来的猪有轻微的非洲猪瘟临床症状。如果用BA71ΔCD2 进行初次免疫，BA71 进行加强免疫，则可获得100%的抗Ken06.Bus 保护率，所有猪几乎不表现非洲猪瘟的任何临床症状。该研究结果证实，交叉保护可能是一种多因素现象，不仅取决于基因序列相似性。

虽然非洲猪瘟病毒基因缺失减毒活疫苗与其他类型的疫苗相比具有很好的免疫交叉保护，但非洲猪瘟病毒的基因修饰结果同样不可预测。首先，不同非洲猪瘟病毒毒株即使缺失相同的基因，产生的致病性和诱导的免疫保护效果可能不同。例如，毒株BA71 缺失CD2v 基因后，毒力降低，并诱导了很好的免疫交叉保护。而同样缺失了CD2v 基因的Georgia2010（基因Ⅱ型）致死性却与亲本无异[51]。毒株E70 缺失DP71L 基因后毒力明显下降，所有接种动物均未出现死亡。而毒株Malawi Lil-20/1（Mal）在缺失DP71L 基因后，致死率仍高达100%[52,53]。马拉维毒株和格鲁吉亚毒株在缺失TK 基因后均表现出减毒，但只有马拉维毒株诱导了免疫猪的保护反应[54,55]。其次，某些天然弱毒株在删除特定毒力基因后，其免疫保护率会明显降低。从OURT88/3 中删除DP71L 和DP96R 基因后，毒力虽然减弱，但是保护效力降为原来的66%[56]。同样，从NH/P68 中删除A238L或是EP153R 基因后，无法再抵抗异源毒株Arm07 的攻击[30]。此外，为了提高LAVs 的安全性，研究者试图通过多重基因缺失来完全去除非洲猪瘟病毒的毒力。发现Georgia 2007 毒株除了缺失9GL 和UK 基因的ASFV-G-Δ9GL/ΔUK[48]毒株外，其他缺失多个基因毒株均不具备诱导保护性反应的能力[57-59]。这些研究证实，基因缺失诱发的免疫保护在很大程度上受毒株特异性的影响。

2020年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所以我国第1 株非洲猪瘟病毒分离株Pig/HLJ/2018 为骨架，利用DNA 同源重组技术，通过删除7 种不同蛋白质的基因片段构建的非洲猪瘟病毒弱毒活疫苗HLJ/18-7GD，对家猪（包括怀孕母猪）具有最好的安全性和有效性[60]。该疫苗可能是目前国内最具备实现产业化应用的疫苗。同年，Borca 等[61]通过删除非洲猪瘟病毒Georgia 2007 毒株的一个未知基因I177L，构建的ASFV-G-ΔI177L 可以100%保护家猪免受亲本株感染，该疫苗既可以肌肉注射也可以经口鼻给药[62]，同时还开发了能够大规模生产的衍生株ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR，该衍生株具有同样的免疫原特性和保护效力[63]。后续的试验还证明ASFV-G-ΔI177L 能抵抗越南强毒株TTKN/ASFV/DN/2019的致死攻击[64]。于是，2022年，越南农业和农村发展部批准了ASFV-G-ΔI177L 在越南的上市，但其实际应用效果和安全稳定性还有待长期观察考证。

6 结语

综上所述，疫苗接种是控制非洲猪瘟的一种有效策略。不同种类的疫苗存在其各自的优势，但也显示出不足。灭活疫苗虽然具有制作简单、安全性高等特点，但却无法保护猪免受非洲猪瘟病毒的侵害。亚单位疫苗能够激发宿主产生体液免疫，诱导产生中和抗体，但针对非洲猪瘟病毒感染产生的保护性免疫并不理想。多项研究指证细胞免疫，尤其是细胞毒性CD8+T 细胞，才是宿主抵抗非洲猪瘟病毒感染的关键。核酸疫苗和病毒载体疫苗的优势在于能够很好地诱导体液免疫反应和细胞免疫反应，但试验阶段呈现出的免疫保护还有待进一步提高。从目前的研究来看，非洲猪瘟病毒重组减毒活疫苗免疫保护效果相对较好，但其也存在病毒返强、疫苗生物脱落、慢性感染等系列安全性问题。近期已有多个非洲猪瘟病毒弱毒疫苗获得了专利认证，并进入临床测试。这给非洲猪瘟商业化疫苗的诞生提供了希望，希望这些疫苗在经过长期的临床试验和优化改良后能克服一系列安全和生产问题成功上市。