跨膜蛋白Lgr5作为胃肠道恶性肿瘤干细胞分子表面标记物的研究进展

陈志达，陈 凛，郗洪庆

解放军总医院第一医学中心普通外科医学部，北京 100853

肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)具有干细胞特性，同时也具有肿瘤细胞的不死性、去接触抑制、迁徙性等固有本质，是导致肿瘤复发和耐药的主要原因[1]。Lgr5蛋白是G蛋白偶联受体家族成员，是由Lgr5基因编码表达的跨膜蛋白，广泛表达于消化道组织，具有极强的干细胞活性，能够持续自我更新，可以分化多谱系子代细胞[2]。近10年来，大量分子生物学、基于免疫抗体反应的基因谱系追踪、类器官培养和小鼠动物实验等研究结果不断证实Lgr5阳性标记细胞具有促进肿瘤发生、发展、转移以及上皮-间充质转化的潜能[3-5]。基于Lgr5蛋白在胃肠肿瘤干细胞中高表达属性，Lgr5蛋白被推荐为胃肠恶性肿瘤干细胞的标记物[6]。为更好地认识跨膜蛋白Lgr5的干细胞标记物属性和特点，本文荟萃追踪近年来Lgr5蛋白作为干细胞标记物在胃肠道肿瘤基础领域的最新进展，并结合信号转导通路和不同胃肠道肿瘤生物学活性特点，梳理分析Lgr5蛋白的标记识别作用、调控诱导机制以及作为靶标临床靶向治疗的潜在可能性，为下一步研究提供理论储备。

1 Lgr5蛋白的结构基础

Lgr5基因大小144 kb，位于12q22 ~ 23染色体区域，内有907个碱基序列的开放式阅读框架编码区域，由此转录翻译产生Lgr5蛋白。Lgr5蛋白的结构与促甲状腺激素、促卵泡激素、促黄体激素受体等其他糖蛋白激素受体相似，都属于G蛋白偶联受体家族(G protein-coupled receptor，GPCR)，但其N末端胞外配体结合区域却显著不同[7]。Lgr5蛋白的N末端细胞外结构由富含亮氨酸的17个重复序列、1个信号肽和7次α-螺旋跨膜的高度保守区域组成，是Lgr5蛋白与糖蛋白配体相互接触的重要结构[2]。

Lgr蛋白家族同属于胞膜蛋白，其中激素受体Lgr1、Lgr2和Lgr3蛋白很早就已经通过分离实验获知其相应的配体。因苦于没有找到相应的配体，Lgr蛋白家族的Lgr4、Lgr5和Lgr6蛋白一直被认为是“孤儿”受体，直到2011年荷兰学者De Lau等[8]在体外培养细胞时发现R-spondin生长因子(R-spondin growth factor)作为配体可以与Lgr4、Lgr5和Lgr6蛋白结合，继而激活相应信号通路发挥作用。

Lgr5蛋白是跨膜蛋白，主要定位在细胞膜表面，通过与配体因子相互作用激活信号通路发挥调控作用。近年来多项研究表明，Lgr5蛋白具有空间动态分布特点，在细胞质和细胞核中也可以检测到Lgr5蛋白的表达[9]。因此，Lgr5蛋白的多次跨膜结构和细胞内分布属性是其介导细胞内外信号传递的重要基础，为Lgr5蛋白标记调控细胞通路影响肿瘤细胞功能提供了可能。

2 Lgr5蛋白标记与信号通路的关系

2.1 Wnt信号通路 Wnt信号通路是目前胃肠道肿瘤Lgr5蛋白相关性研究较为集中的通路。在Lgr5蛋白参与肿瘤发生、进展和转移过程中，受到强化的Wnt信号通路是最核心的通路途径，刺激肿瘤干细胞增殖和自我更新[10]。当它被异常激活后，将会促进胃癌细胞的增殖、迁移和EMT转化，进而影响胃癌细胞的耐药能力，而且Wnt/βcatenin 信号通路也被认为是驱动组织修复和干细胞自我更新的关键途径。

由成纤维细胞分泌的顶部盘状底板反应蛋白(roof plate-specific spondins，RSPOs)是Lgr5蛋白的特异性配体，两者相结合后以二聚体的形式存在[11]。两者结合可以抑制β-连环蛋白(β-catenin)的泛素化降解复合体功能，导致β-catenin累积增多[12]，激活TCF转录因子，竞争性结合TCF4蛋白，形成中介复合物，驱动Wnt通路信号下游的靶基因转录过程，对胃肠道肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、EMT转化和耐药等过程发挥作用[13-14]。

2.2 Hedgehog信号通路 在正常成年人体内该通路表达静默，但在胃肠道肿瘤组织中十分活跃，并与肿瘤的增殖分化、细胞凋亡、血管新生、侵袭及转移有关[15-16]。该通路被激活时，释放配体蛋白SHH与Ptch蛋白结合，解除Ptch蛋白对Smoothed (Smo)的抑制，而Smo蛋白可以进入细胞核内转导引发级联反应，刺激转录因子胶质细胞瘤转录因子1转录表达，进而改变细胞生物学特性，促进肿瘤增殖和上皮间质转化[17-19]。

2.3 Hippo信号通路 Hippo信号通路高度保守。不同于其他信号通路，Hippo没有特异性受体和配体，通路的核心是接收上游G蛋白偶联受体信号或活化的酪氨酸激酶调控引起激酶级联反应，通过降解或积累下游效应因子YAP来完成CSC稳态调节[20]。正常状态下，YAP可以参与和诱导EGFR、Notch信号通路启动肠道干细胞暂时性再生功能，修复肠道黏膜损伤[21]。而在胃肠道肿瘤发展过程中，细胞核中的YAP又可联合β-catenin蛋白、TCF4形成结构复合体，以Lgr5作为靶基因，驱动胃肠道肿瘤细胞侵袭和迁移[22]。

3 Lgr5蛋白标记与胃肠道恶性肿瘤生物学活性的关系

3.1 胃癌 在正常胃部组织中，Lgr5蛋白主要局限表达于成熟幽门腺体的底部，并且具有自我更新能力，承担着胃上皮细胞组织的长期更新工作。但当胃黏膜上皮细胞发生肠上皮化生，Lgr5蛋白又转变角色，成为促癌蛋白，促进胃癌的发生发展[23]。Barker等[24]首次通过体外实验验证了Lgr5+干细胞驱动胃上皮组织的自我更新的能力，并提出Lgr5蛋白可以作为干细胞研究稳定标记物的论断。随后，Yamanoi等[25]通过逆转录PCR扩增技术也发现了Lgr5蛋白双重身份属性，在蛋白质合成的第一步，即基因转录的mRNA水平，Lgr5在胃癌组织中表达即显著高于正常胃黏膜组织。

胃癌组织中Lgr5蛋白异常升高的程度与患者生存预后密切相关，人们开始将Lgr5蛋白视为胃癌预后的独立预测因子。Liu等[26]发现，Lgr5+患者中位生存期较Lgr5-患者减少26个月，提示我们Lgr5蛋白高表达状态预示较低生存率。分析其原因，除了Lgr5蛋白能够维持胃癌CSC的“干”性导致肿瘤难治难控的特点以外，Lgr5蛋白表达与胃癌的TNM临床分期密切相关。一项纳入257例Ⅰ、Ⅱ期胃癌术后患者的研究中发现，N0~1亚群中Lgr5+患者5年总生存率显著低于Lgr5-患者(89.4%vs54.4%)，T1~2亚群中，Lgr5+患者5年无病生存率显著高于Lgr5-患者(94.1%vs0)[27]。

相较于CD133、CD44、上皮细胞黏附分子、ABCG2等其他跨膜蛋白类胃癌相关标记物，Lgr5蛋白具有维持胃癌CSC持续更新的能力，因此Lgr5蛋白被视为突破CSC耐药困境的新策略靶点[28]。

3.2 结直肠癌 众多研究发现，通过干扰或敲除等方式调低Lgr5蛋白的表达，可以抑制结直肠肿瘤的干细胞自我更新能力。Gzil等[29]的病理学分析发现，Lgr5蛋白表达程度与结直肠肿瘤分化程度、浸润深度、TNM分期高度相关，即低分化、深度浸润和晚期分期的结直肠肿瘤中存在Lgr5蛋白高表达。且Lgr5蛋白高表达患者更容易出现淋巴结转移和远处器官转移，其机制主要通过两种方式实现：(1) Lgr5+肿瘤干细胞可能承担转移性肿瘤干细胞的作用，促进肿瘤细胞的播散和转移；(2) Lgr5蛋白通过诱导上皮细胞 - 间充质转换过程，促进肿瘤细胞的转移发生。因此，依据以上两种作用方式，Lgr5蛋白可以作为判断结直肠肿瘤预后的重要参考因素。

Liu等[30]研究发现，在直肠肿瘤患者中，Lgr5蛋白高表达组放疗有效率低于对照组，而且更容易出现化疗药物的耐药性，导致肿瘤复发或进展。近年来，Lgr5蛋白高表达导致肿瘤细胞耐药性成为探究肿瘤细胞耐药性原因的重要方向。

对分选Lgr5标记后的结肠癌肿瘤细胞系使用10 µg/mL伊立替康药物3 d，发现肿瘤细胞停止增殖，只有约50%的细胞存活，暂时失去Lgr5标记，且Lgr5 mRNA水平显著下降。然而，把抗肿瘤药物处理因素去除后，又可以通过免疫反应检测到19% ~ 43%的细胞有Lgr5表面标记。用5-氟尿嘧啶和奥沙利铂药物处理，也获得了相同的结果[31]。以上结果也提示我们Lgr5+CSC在化疗治疗时可暂时性转为Lgr5-状态，以逃脱化疗药物的捕杀；当化疗药物浓度下降或消失时，再由Lgr5-转为Lgr5+状态并恢复肿瘤细胞大量快速增殖。因此，如何能够紧紧锚定Lgr5+CSC，避免脱靶现象，成为药理学家关注的重点。

4 结语和展望

Lgr5蛋白的广泛消化道实体肿瘤高表达特点以及与肿瘤生物学活性的高度相关性，显示出其作为抗癌治疗靶点的潜力。通过深入研究基因组编辑技术或源于抗体特异性免疫反应靶向投送药物的传递送系统，达到调控实体肿瘤中Lgr5表达，将成为抗耐药治疗的突围点[32]。

此外，调控Lgr5在稳态干细胞和CSC中表达的分子机制尚不清楚，如果我们能够进一步掌握多面的Lgr5复杂调节机制，将可以极大地推动Lgr5靶向治疗的进步。虽然该领域已经在干细胞和体外器官培养疾病建模方面取得了巨大的进步，但距离临床应用仍然很远。通过将基因组编辑技术与类器官培养相结合，有可能更加真实地模拟疾病发展过程，并跟踪Lgr5+干细胞在正常生理和癌症环境中的生物学行为特点。以Lgr5为干细胞标记物和在多信号通路背景下研究Lgr5+干细胞特点，应用于肿瘤疾病建模、耐药性机制研究、药物靶向投送系统、动物模型移植等方向，将是未来肿瘤干细胞生物学研究的前景领域和必经途径。

作者贡献陈志达：论文书写，文献检索及整理；陈凛：选题指导；郗洪庆：论文校审；课题基金支持。

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