抗革兰氏阴性菌抗菌肽在畜牧业应用研究进展

喻家晓，张明辉，高学军

（长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434023）

革兰氏阴性菌泛指革兰氏染色反应呈红色的细菌。主要的致病性革兰氏阴性菌（Gram negative bacteria，G-菌）有大肠埃希菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等，这些细菌会引起腹泻、尿路感染、呼吸道感染、败血症等疾病，对人类健康构成极大威胁，也给畜牧生产造成重大经济损失。由于抗生素滥用和细菌耐药性的出现，治疗这些疾病变得越来越困难。G-菌的细胞膜由内膜、细胞间质和外膜组成。内膜由疏水的α-螺旋结构的膜蛋白构成对称的磷脂双分子层；细胞间质中含有大量肽聚糖；外膜是高度不对称的脂双层，外膜内层为磷脂层，外层主要由脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）组成并包含一些对外环境具有抵抗作用的亲水β-折叠结构外膜蛋白。脂多糖能够吸附Mg2+和Ca2+等阳离子形成非常紧密的堆积层，形成渗透屏障，使它们在允许营养物质进入的同时能够有效地屏蔽抗生素等药物的进入[1]。

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是一种由核糖体合成的多为小于10 kDa 的带有正电荷的两亲性分子多肽，具有抗细菌、真菌、病毒和低细胞毒性等优点，且不易产生耐药性[2]。因此，AMPs 正逐渐成为新一代抗致病性G-菌药物。

1 AMPs 的分类及结构

AMPs 广泛分布于多种生物中，是机体先天免疫系统的重要组成部分。根据来源不同可将其分为动物、植物、微生物以及人工合成四大类。

1.1 动物来源的AMPs

动物来源的AMPs 可分为昆虫抗菌肽、水生动物抗菌肽、哺乳动物抗菌肽及两栖动物抗菌肽。昆虫源AMPs 根据其结构及功能的不同分为4 大类，包括天蚕素（Cecropins）、昆虫防御素（Insect defensins）、富含脯氨酸抗菌肽（Proline-rich peptides） 和富含甘氨酸抗菌肽（Glysine-rich peptides）。水生动物源AMPs 从贝类、鱼类、水生无脊椎动物等分离得到，如Moronecidin、鲎素、Piscidins类、Defensin 类等[3]。哺乳动物源AMPs 主要存在于动物皮肤黏膜、免疫器官以及中性粒细胞，可根据其结构和生物学特征分为防御素类和Cathelicidins 家族两大类。两栖动物源AMPs 根据其结构特点可分为含有分子内二硫键的环状肽和具有α-螺旋结构的线性肽，如Magainin II、Bombinins，具有良好抗菌作用[4]。

1.2 植物来源的AMPs

AMPs 存在于植物的根、茎、叶、花、果实和种子中，并且多存在于植物外层，能抵御病原体的侵入。常见的种类包括硫堇、植物防御素、橡胶蛋白、Knottins、脂转移蛋白和Snakins；不太常见的种类包括Cyclotide、2S Albumins、β-Barrelins、Ib-AMPs、MBPs和Shepherin[5]。

1.3 微生物来源的AMPs

细菌分泌的AMPs 也称为细菌素，是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有生物活性的多肽或前体多肽。细菌素均由细菌核糖体直接翻译合成，存在较多的翻译后修饰的称为Ⅰ类细菌素，其他称作Ⅱ类细菌素[6]。两类细菌素按照各自结构特点又分为若干亚类，如Lantibiotics、Labyrinthopeptins 和Sanctibiotics。近年来研究发现，细菌分泌的AMPs 如Ⅰ类细菌素通常比真核生物产生的AMPs 更有效抑制有害细菌。

1.4 人工合成AMPs

目前较为成熟的人工制备抗菌肽的方法有三种：一是根据AMPs 氨基酸序列，通过化学合成的方法获得AMPs；二是通过基因工程技术，将编码AMPs 的基因导入到表达载体内，获得产量较高的AMPs；三是通过蛋白酶催化水解特定蛋白质获得具有抗菌活性的AMPs[3]。

1.5 AMPs 的结构

AMPs 通常由12～80 个氨基酸残基组成，其中绝大部分是电荷携带量在（+2）～（+9）之间的阳离子短肽，其中带有（+2）～（+4）电荷的AMPs 最为丰富[7]。按照AMPs 二级结构特点不同将其分为α-螺旋型、β-折叠型、环链结构型和无规则卷曲型4 种。

α-螺旋型AMPs 的多肽链N 端富含亲水的碱性氨基酸（Lys 和Arg），形成一个带正电荷的亲水区域，C 端则由较多的疏水氨基酸形成疏水亲脂的α-螺旋型，两个α-螺旋型之间靠Gly 和Pro 形成铰链区。该类AMPs 主要包括Cecropins 家族、蛙皮素、Cathelindia 等。典型的β-折叠型AMPs 是动物防御素，广泛存在于中性粒细胞及多种上皮组织中，一般含有38～42 个氨基酸残基。动物防御素可以分为α 型和β 型，含有β-折叠结构，β-折叠之间靠二硫键相连。环链结构型AMPs 多肽链的C 端或中部可以形成环状结构，环的两端或N 端为线状结构，如来自中性粒细胞分泌的Bactenecin。无规则卷曲型AMPs 则没有特定的结构，如免疫调节肽Cathelicidin[4]。

2 AMPs 作用机制

不同的AMPs 具有不同的抗菌活性谱，例如Magainins、Defensins 和LL-37 对许多G-和G+菌均具有活性，植物防御素主要杀灭真菌，而细菌素通常只抑制竞争菌株的生长[8]。AMPs 主要作用机制为：带有正电荷的AMPs 会与G-菌外膜上的LPS 结合，通过静电相互作用结合到细菌表面；接着AMPs 的非极性部分通过疏水作用插入细菌细胞的脂质双分子层中，取代Ca2+、Mg2+等稳定磷脂的二价阳离子，从而导致膜结构的破坏。AMPs 破坏细胞膜导致细菌细胞膜去极化、膜电位下降、膜通透性改变、细胞内大分子物质泄漏，最终导致细菌死亡[9]。研究表明，部分AMPs 通过细胞膜后作用于细菌细胞内不同的靶点，通过抑制DNA 和RNA 的合成、降低蛋白质合成的速率、抑制蛋白质折叠、干扰酶活性、抑制细胞壁的合成和一些其他的途径，进一步发挥杀菌作用[10]。

3 抑制G-菌的AMps

3.1 Protegrin-1

Protegrin-1（PG-1）从猪中性粒细胞中分离获得，属于Cathelicidin 家族哺乳动物防御素成员，由18 个氨基酸组成。PG-1 对典型G+菌和G-菌的最低抑菌浓度（MIC）为0.12～2 mg/L，低浓度时可明显抑制大肠杆菌和枯草芽孢杆菌[11]。

3.2 LL-37

LL-37 由巨噬细胞、单核细胞等分泌，由37 个氨基酸组成，电荷携带量为+6，其N 端前含有2 个Lys 残基，具有两亲性α 螺旋结构，属于Cathelicidin 家族。LL-37 对G+菌和G-菌均有抑制作用，LL-37 对哺乳动物细胞毒性低，并且具有抗炎作用，是治疗G-菌败血症的良好候选药物[12]。

3.3 Citropin 1.1

Citropin 1.1 是一种两栖类肽，含有α-螺旋结构，由16 个氨基酸组成。Citropin 1.1 对G+菌和G-菌均有抑制作用，同时还具有免疫调节作用。Citropin 1.1 能够显著减少大肠杆菌败血症小鼠的血浆内毒素和炎症细胞因子含量。对Citropin 1.1 进行结构修饰后，其类似物的抗菌活性、稳定性明显增强[13]。

3.4 Magainin II

Magainin II 是两栖类动物皮肤中产生的肽，属于防御素类，具有α-螺旋结构。Magainin II 对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的MIC 值为32 ～128 mg/L，对大肠杆菌的MIC 值为121 mg/L[14]。

3.5 Cecropins

Cecropins 由34～39 个氨基酸残基组成，分为6种类型（A、B、C、D、E 和P1），其中天蚕素A、B、D 是天蚕素家族的主要成员，分子量大小十分接近，且三者之间氨基酸序列的同源性非常高。其中Cecropin B 含有35 个氨基酸，抗菌活性最强，并且对细菌、真菌、病毒、原虫和某些肿瘤细胞均具有显著的抑制杀伤效应[15]。Cecropins 在抑制G-菌方面有着较好的应用前景。

3.6 Tachyplesin Ⅲ

Tachyplesin 是从鲎的血细胞中提取得到，由17～18 个氨基酸组成的含有两个二硫键结构的阳离子多肽，属于宿主防御肽，具有广谱抗菌活性，其家族成员Tachyplesin Ⅲ可以作为败血症治疗药物进行研究开发[16]。

3.7 Colistin 黏菌素

Colistin 是从多黏类芽孢杆菌中分离获得的环状阳离子多肽，对大多数G-菌均具有很强的抑制作用，但其临床应用受到药代动力学特性和肾毒性风险的明显限制[17]。

4 抗G-AMPs 在畜牧业中的应用

4.1 在家禽养殖中的应用

4.1.1 在肉鸡养殖中的应用

在饲料中添加抗G-AMPs 可明显改善肉鸡的生长性能、减轻炎症反应、提高饲料利用率和动物的成活率[18]。在18 胚胎日卵内添加禽β-防御素能够显著降低由禽致病性大肠杆菌引起的早期雏鸡死亡率[19]。在饲料中添加0.05%和0.10%AMPs 时，肉鸡的平均日增重显著高于未添加组；0.10%AMPs 组胸腺指数、脾脏指数、IgA、IgG、IgM 含量均显著升高，表明添加一定比例的AMPs 可使肉鸡的机体免疫力处于较优水平、促进肉鸡生长[20]。PG-1对禽源沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌效果强于抗生素，在禽饲料中添加PG-1 可显著提高家禽的生长性能和抗病能力[21]。试验结果表明添加不同剂量天蚕素AMPs 可以增强感染鼠伤寒沙门氏菌肉鸡机体免疫反应，降低器官病变程度，显著改善肉鸡生长性能，降低感染造成的损失[22]。

4.1.2 在蛋鸡养殖中的应用

AMPs 可提高产蛋鸡生产性能，改善蛋品质、营养物质利用率及免疫功能。添加AMPs 后蛋鸡的免疫功能、抗氧化能力、产蛋率、蛋壳厚度、蛋壳硬度以及粗灰分利用率均有提高；在产蛋后期蛋鸡日粮中添加200～400 mg/kg AMPs 效果最好[23]。日粮中添加抗G-AMPs（细菌素、天蚕素等），与对照组相比蛋鸡的料蛋比显著降低，回肠绒毛高度显著提高，添加30～100 mg/kg 抗G-AMPs（细菌素、天蚕素等）均可改善回肠肠道黏膜形态，降低蛋鸡肠道内有害微生物数量，提高产蛋率、料蛋比和生产性能[24,25]。

4.1.3 在其他家禽养殖中的应用

AMPs 可提高鸭、鹅、鹌鹑等禽类的生长性能，改善动物的肠道健康，提高免疫力，促进免疫器官发育等。添加AMPs 显著降低了肉鸭盲肠中大肠杆菌菌落数[26]。在白羽番鸭母雏日粮中添加天蚕素AMPs，雏鸭成活率高达96.67%，显著高于未添加组；降低了肠道大肠杆菌，增加乳酸杆菌数；提高平均日增重、降低料重比[27]。添加50、100、200 mg/kg AMPs 后，鹌鹑的产蛋率、蛋壳厚度、蛋黄颜色均有提高[28]。张雪等研究了AMPs 对鹌鹑免疫功能、肠道菌群的影响，发现添加300 mg/kg AMPs 组α1、α2、β、γ 球蛋白含量比未添加组分别高84.57%、13.64%、18.45%、14.41%；IgA、IgG、IgM 含量明显高于未添加组；盲肠沙门氏菌显著降低，肠道内乳酸杆菌、双歧杆菌数增加；鹌鹑胸腺指数增加8.26%[29]。

4.2 在家畜养殖中的应用

各种G-菌引起的腹泻等疾病给畜牧生产带来重大的经济损失，使得抗G-AMPs 在畜牧业中应用迫切和具有广阔的前景。抗G-AMPs 能抑制病原菌的生长、改善畜禽肠绒毛结构、增强动物免疫能力，提高饲料转化率，从而提高家畜的生长性能。例如感染大肠杆菌仔猪和断奶仔猪饲喂抗G-AMPs（天蚕素AD）饲料后，可有效降低仔猪腹泻率，调节断奶仔猪肠道菌群，仔猪免疫功能明显增强，改善仔猪的生长性能[30,31]。试验结果表明，在湖羊养殖生产中使用4、8 g/（只·d）AMPs 粗提物可以显著提高其试验末体重及平均日增重，并显著降低料重比[32]。在基础饲粮中添加0.03% AMPs可提高犊牛平均日增重、日采食量和断奶体重，超氧化物歧化酶（SOD）水平和血清免疫球蛋白M（IgM）水平提高，同时减少腹泻发生率，改善断奶犊牛肠道菌群、生长性能和健康状况[33]。

5 展望

目前，AMPs 已广泛用于兽医学、疾病预防学以及畜禽养殖中，AMPs 对畜禽类生长性能的影响研究逐渐增多。大量研究表明AMPs 在一定程度上能够提高畜禽生长性能，增强动物免疫能力，且具有无药物残留、无污染环境的特性。在饲料中添加抗G-AMPs 能很好地抑制革兰氏菌和耐药菌等的增殖，降低畜禽感染G-菌造成的损失。但AMPs 的研究和应用仍存在一些问题和挑战。例如，AMPs 规模化制备和纯化尚需高效的技术工艺，新的AMPs 还需进行大量临床试验来评估其安全性、有效性以及最佳的使用剂量和方式。随着对AMPs 研究的不断深入，相信AMPs 将会成为治疗G-菌感染的重要手段，在治疗腹泻等动物疾病方面发挥巨大作用，为畜牧生产保驾护航。□