基于高通量测序技术对母亲和新生儿真菌群落结构关系的研究

郑欣 程旭梅 雷胜男 周建业 李志强

(西北民族大学 口腔医学国家民委重点实验室 甘肃省口腔疾病研究重点实验室, 兰州 730030)

新生儿口腔黏膜或其不成熟的免疫系统发生真菌定植和感染是非常严重的问题。据统计,40%～80%的新生儿念珠菌感染与白念珠菌定植有关[1]。新生儿口腔念珠菌定植是发生念珠菌败血症的危险因素之一[2]。新生儿出现败血症的体征和症状时,也应该考虑到马拉色菌、曲霉和接合菌感染的可能性[3]。鉴于真菌感染可能产生的严重后果,防止真菌的早期定植对新生儿群体而言至关重要。

与新生儿细菌微生物组相比,新生儿真菌微生物组的结构及其与母体真菌微生物组的潜在联系较少受到关注。利用高通量测序技术可以研究母亲与新生儿真菌群落结构的相关性。目前已有针对性的研究证明特定真菌的传播方式是母婴垂直传播[4-5]。然而,真菌定植是如何发生的,新生儿出生时母婴之间是否存在特定方式的真菌传播,这些仍然是未知的。大量关于新生儿口腔细菌菌群的研究表明,新生儿口腔细菌菌群可以在出生前从母亲处获得[6]。新生儿细菌群落的形成和发展很大程度上取决于母代、出生方式及环境等因素[7-8]。胎盘和羊水是胎儿的栖息地,母体和胎儿不仅通过它们交换营养物质、内分泌信号、细胞因子和生长因子,同时也通过它们传播微生物[9-10]。胎盘和羊水的菌群组成与口腔相似,母体口腔菌群会影响胎盘和羊水菌群,并参与胎儿初始菌群的建立[11-12]。由于口腔当中同时存在细菌和真菌,因此不排除新生儿口腔真菌来源于母亲的可能性。

在本研究中,我们从母体口腔、胎盘、羊水和新生儿口腔中采集样本,比较了4个位点的真菌群落结构特征。通过高通量测序技术分析母亲与新生儿真菌群落的相关性,进一步加深对真菌群落建立的认识。

1 材料与方法

1.1 材料

样本采集 选取在甘肃省妇幼保健院通过剖宫产分娩的25名健康孕妇为研究对象。所有研究对象年龄均在22～36岁;孕期37周以上;无口腔疾病;无糖尿病或与妊娠相关的全身性疾病;过去6个月未使用过抗生素。本研究获得西北民族大学医学伦理委员会的批准,研究对象均签署了知情同意书。从以下4个位点采集样本:母体口腔、胎盘、羊水、新生儿口腔。新生儿出生后立即用无菌拭子采集新生儿及其母亲的口腔样本,同时立即采集母亲的羊水和胎盘组织样本,用一次性无菌针收集羊水2 mL,手术剪取胎盘组织标本。所有样品均在无菌条件下处理后冷冻在-80 ℃。

试剂及仪器设备 E.Z.N.A.©HP真菌基因组DNA提取试剂盒 (美国 Omega公司);AMPure XP磁珠核酸纯化试剂盒(美国Beckman 公司);适用于Illumina平台的文库定量试剂盒(美国Kapa biosystems公司)。PCR仪美国(Bio-Rad公司);Qubit荧光计(美国Invitrogen公司);Agilent 2100生物分析仪(美国Agilent公司);Illumina Miseq测序仪(Illumina公司)。

1.2 方法

DNA提取和测序 使用E.Z.N.A.©HP真菌基因组DNA提取试剂盒按照说明书步骤提取总DNA。对真菌18S和28S rDNA的ITS2区进行扩增,采用的上游引物为:fITS7(5'-GTGARTCATCGAATCTTTG-3'),下游引物为:ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'),并用特异性条形码对引物5'端进行标记[13]。反应体系为25 μL:模板DNA 25 ng, PCR预混物(NEB,M0536L) 12.5 μL,上下游引物(1 μmol/L)各 2.5 μL,ddH2O补齐至10 μL 。反应条件为:98 ℃ 30s;98 ℃10 s, 54/52 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35个循环;72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测,然后用AMPure XP磁珠核酸纯化试剂盒进行纯化,用AMPure XP磁珠核酸纯化试剂盒进行定量分析。分别用Agilent 2100生物分析仪和适用于Illumina平台的文库定量试剂盒测定测序文库的分子量和浓度。样本送至杭州联川生物技术股份有限公司,利用 Illumina Miseq平台进行高通量测序。

数据分析 采用VSEARCH(v2.3.4)软件在97%相似度水平上对序列进行操作单元(operational taxonomic units,OTUs)聚类。为每个OUT挑选代表性序列,用RDP(Ribosomal Database Project)软件将分类标准分配给每个代表性序列。利用MAFFT(v7.310)软件比对OTU代表序列,分析不同OUT的系统发育关系。利用QIIME (version 1.8.0)软件计算多样性指数,评估alpha多样性。利用主坐标分析(PCoA)和聚类分析(QIIME)软件(version 1.8.0)分析beta多样性。利用SPSS 22. 0 软件进行数据统计分析。

2 结 果

2.1 一般资料

本研究共收集通过剖宫产分娩的健康孕妇25名,孕期37周以上,年龄范围22～36岁,平均年龄为(29.04±2.26)岁。所有研究对象均为兰州市城市居民,没有特殊生活习惯。

2.2 测序结果及OTU分布

经过滤得到所有样本中母体口腔、胎盘、羊水、新生儿口腔4个位点的序列总数分别为375495、417396、431265和474730。在97%的相似性水平上聚类得到460个操作分类单位(OTU),其中有54个OTU是4个组共有的,新生儿口腔特有的OTU有22个,母体口腔特有的OTU有91个,羊水特有的OTU有66个,胎盘特有的OTU有75个(见图1A)。通过比较四组共有OTU的相对丰度,发现羊水和胎盘之间没有显著差异,新生儿口腔和母体口腔之间也没有显著差异(见图1B)。

图1 4个组真菌OTU韦恩图(A)和共有OTU的相对丰度(B) 图2 4个组真菌群落alpha多样性指数Chao1 (A)和 Shannon (B)Fig.1 OTUs Venn diagram of four groups (A) and the relative aundance of the shared OTUs (B) Fig.2 Alpha-diversity of fungal community in four groups by Chao1 (A) and Shannon (B)

2.3 alpha多样性分析

alpha多样性指数可评估单个样本的真菌多样性。Chao1指数越大,群落丰富度越高。Shannon指数越大,群落多样性越高。胎盘群落丰富度最高,新生儿口腔最低(见图2A)。母体口腔、羊水和胎盘Shannon指数没有显著差异(P>0.05),但新生儿口腔与其他各组比较Shannon指数统计学差异显著(P<0.05) (见图2B),说明母体口腔、胎盘和羊水中的真菌群落多样性相似。

2.4 门和属水平上的真菌分布

将从所有样本中获得的序列分别在门水平和属水平进行分类,并评估它们各自的相对丰度(见图3)。在3%的差异水平上聚类形成的460个OTU可划分为6个门,168个属。4个组在门水平上的相对丰度见图3A。优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota),相对丰度分别为36.16%～58.41%和40.55%～61.33%。羊水和胎盘子囊菌门的相对丰度(55%～58%)显著高于新生儿口腔和母体口腔(36%～40%)(P<0.05),而新生儿口腔与母体口腔差异没有统计学意义(P>0.05),羊水与胎盘差异也没有统计学意义(P>0.05)。 另一优势菌门担子菌门的相对丰度在新生儿口腔与母体口腔间差异没有统计学意义(P>0.05),羊水与胎盘差异也没有统计学意义(P>0.05)。

图3 门水平(A)和属水平(B)的真菌群落分布 图4 PCoA主坐标分析(A),PC1和PC2比较;属水平的多样本相似性树(B)Fig.3 The fungal community composition at phylum level (A) and genus level (B) Fig.4 Principle Co-ordinates analysis (A), the insert boxplots show the comparison of PC1 and PC2 between groups;Multiple groups similarity tree at genera level (B)

4个组在属水平上的相对丰度如图3B所示。检出率> 1% 的优势属有10个,4组共有的优势属为红酵母属(Rhodotorula,12.4%～35.3%)、Davidiella(7.6%～13.5%)、Meyerozyma(5.6%～11.4%)、马拉色菌属(Malassezia,5.9%～10.9%)和隐球菌属(Cryptococcus,4.6%～11.0%),其中Davidiella和马拉色菌属的相对丰度相近(P>0.05),Meyerozyma和隐球菌属的相对丰度在4组间差异没有统计学意义(P>0.05)。 其他属在4个组中所占比例较低,相对丰度相近。

2.5 群落相似性分析

利用UniFrac软件加权距离测量进行主坐标分析(PCoA),比较4个组间真菌群落结构的总体变化(见图4A)。PC1和PC2对真菌群落结构变异的贡献率分别为44.5%和30.2%。通过比较PC1和PC2的值,又可将4个组分成两个组群,一组为新生儿口腔和母体口腔,另一组为羊水和胎盘,表明新生儿口腔和母体口腔真菌群落结构相似,而羊水和胎盘群落结构相似(见图4A)。

采用多样本相似性树对四组真菌群落结构进行聚类分析(见图4B),在属水平上新生儿口腔和母体口腔聚为一类, 羊水和胎盘聚为一类,表明新生儿口腔和母体口腔的真菌群落结构相似,而羊水和胎盘的真菌群落结构相似。与羊水和胎盘相比,新生儿口腔和母体口腔中的优势属明显更为普遍。相似性树分析结果与 PCoA分析结果相似。

3 讨 论

为了避免母亲阴道分娩时可能发生的阴道感染,本研究的研究对象均为剖宫产孕妇,并在无菌手术室进行无菌手术,以排除接触感染的可能。新生儿的皮肤、口腔和肠道细菌微生物群落主要按照分娩方式聚集,已有研究证明剖宫产会影响产妇分娩时微生物群的传播模式[14]。实际上对于真菌群落而言,只有关键体位的特异性类群会受到出生模式的影响,而不是整个真菌群落结构受影响,因此出生模式并不影响我们对新生儿口腔真菌群落的研究[8]。

各样本共有的类群主要负责群落的整体结构。本研究结果显示4个组的共有OTU有54个,且各组序列以共有OTU为主,占比为71.9%～84.1%,说明4个组的真菌微生物组具有相似性。羊水与新生儿口腔微生物群落丰富度差异不显著,说明羊水与新生儿口腔微生物组成关系密切。羊水是羊膜腔中的保护性液体,在孕期胎儿的发育和成熟过程中发挥着重要作用。胚胎形成早期,羊水是胎儿细胞外基质的延伸,胎儿和羊水之间通过细胞外区发生双向自由扩散。妊娠8周时,胎儿尿道形成,肾脏开始产生尿液。妊娠20周时,胎儿就开始吞咽。胎儿皮肤在妊娠19～ 25周逐渐角质化,此时胎儿尿液、呼吸道、胃肠道、脐带和胎盘表面的分泌物成为羊水的主要来源[15]。随着胎盘和胎儿血管的形成,母体血浆中的水和溶质弥散到羊水中[16]。因此,羊水中的真菌可能被胎儿吞下,并在出生前植入胎儿口中。本研究中母体口腔、羊水和胎盘中真菌群落多样性相似,说明母体口腔、羊水和胎盘中存在相似的真菌群落,这进一步证明母体口腔中的真菌可能向羊水和胎盘传播。新生儿口腔真菌群落丰富度和多样性最低,提示新生儿口腔真菌群落不成熟。由于新生儿体内定植的真菌较少,新生儿出生后的第1个月体内真菌多样性并没有增加,并且身体任何部位的真菌群落都没有明显成熟[8]。本研究中相似性树的分析结果表明,母亲和新生儿口腔真菌群落结构相似,说明母亲和新生儿口腔真菌菌群关系密切。尽管胎儿获得微生物的时间和特点目前仍不清楚,但我们的结果表明,新生儿口腔真菌定植发生在出生之前。 我们甚至可以推测,母体口腔微生物可以通过血液进入胎盘和羊水,间接影响胎儿口腔微生物的早期形成。

本研究在4个组中检测出2个共有优势菌门:子囊菌门和担子菌门,5个共有优势属:红酵母属、Davidiella、Meyerozyma、马拉色菌属和隐球菌属,与其他的研究结果相似[17-18]。表明大部分母体口腔真菌也存在于在新生儿口腔、胎盘和羊水中。这些优势菌可能借助血液或免疫细胞到达母胎界面,然后穿过胎盘到达羊水,最终在新生儿口腔中定植。环境和皮肤等其他来源也可能有助于生命早期真菌群落的形成。本研究中新生儿虽未经阴道分娩,但由于子宫与阴道相连,母亲阴道中的微生物群也可能逆行进入胎盘和羊水,并被胎儿口腔环境选择性的定植与母体口腔相似的真菌群落。

本研究利用高通量测序技术分析母亲与新生儿真菌群落结构的相关性,推测新生儿口腔真菌可能起源于母体口腔,为进一步研究母婴口腔真菌群落相关性和新生儿口腔初始真菌来源提供了一定的理论依据,为母婴口腔真菌传播通路研究奠定了理论基础。由于样本量偏少且为单中心,今后需要进行更大规模的研究以验证我们的结果。此外,未来还可对真菌和细菌微生物群落的协同发育进行纵向研究。虽然本研究发现母体口腔真菌可能通过胎盘和羊水传播到新生儿口腔,但母婴之间真菌传播的具体途径以及传播的真菌对新生儿健康的影响尚未可知,仍有待进一步研究。