皮肤恶性黑色素瘤组织miR-205、miR-367 表达及其临床意义

张丽君,严伟恒,黄国庆,孙充洲 （电子科技大学医学院附属绵阳医院/绵阳市中心医院烧伤整形外科，四川 绵阳 621000）

恶性黑色素瘤（malignant melanoma,MM）为侵袭性强的恶性肿瘤，多发生于皮肤、黏膜等组织，易转移，患者预后较差[1]。皮肤恶性黑色素瘤（cutaneous malignant melanoma,CMM）为原发灶在皮肤的MM，发病率占全身恶性肿瘤的1%～3%，且呈上升趋势[2]。虽然医疗诊断技术不断改进，但多数患者确诊时已发生转移。故寻找新型有效的治疗靶点成为临床研究热点。miRNAs 为非编码小分子RNA，参与生命活动的调控过程，尤其是在肿瘤发生发展中发挥重要作用[3]。miRNAs 在不同组织中有不同生物学作用，不同miRNAs 可靶向调控不同信号通路，发挥基因调控作用[4]。miR-205是在多物种间高度保守的miRNA，具有抑制肿瘤的作用[5]。研究发现，miR-205在乳腺癌[6]、前列腺癌[7]中表达下调。miR-367 位于4 号染色体q25区，其在肿瘤、心血管疾病等中具有重要调控功能，在不同疾病中可通过靶向调节靶基因发挥不同生物学作用，其可增强血管平滑肌细胞增殖能力，并抑制肿瘤细胞凋亡[8]。但关于miR-367 在CMM 组织中的作用尚不清楚，需要进一步研究。因此，本研究通过分析miR-205、miR-367 在CMM 组织中的表达情况，并分析其与患者临床病理特征及预后的关系，旨在为临床诊疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2013年5月至2019年12月我院收治的85例CMM 患者，以莫氏手术术中切除的肿瘤组织为CMM组。其中男48 例，女37 例；年龄29～77 岁，平均（56.68±2.31）岁；肿瘤位置：四肢39 例，非肢端46 例；美国癌症联合会第7 版肿瘤分期[9]：Ⅰ期27 例，Ⅱ期33 例，ⅢA～B 期25 例；溃疡33 例，无溃疡52 例；淋巴结转移36 例，未转移49 例。纳入标准：①符合《中国黑色素瘤诊治指南（2011 版）》中CMM 的诊断标准[10]，且经病理检查确诊；②临床分期为ⅠA～ⅢB 期，具有手术指征；③术前无放疗、激光治疗等；④临床资料完整。排除标准：①合并严重慢性病；②合并其他恶性肿瘤；③原发灶于皮肤外；④存在活动性病毒或细菌感染；⑤合并精神疾病。另选取同期于本院治疗的80 例皮肤良性色素痣患者的痣组织标本作为对照组，其中男45 例，女35 例；年龄27～76 岁，平均（56.73±2.46）岁；发病位置：四肢41 例，非肢端39 例。2 组患者性别、年龄、发病位置比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经我院伦理委员会批准[2013 伦（审）N0406011]，患者对本研究知情同意。

1.2 临床资料收集

收集CMM 患者性别、年龄、溃疡、肿瘤直径、临床分期、肿瘤侵袭性、Karnofsky 功能状态（Karnofsky performance status,KPS）评分（总分0～100 分，得分越低表示患者健康状态越差）、原发灶厚度、Clark 分级、淋巴结转移等临床资料。CMM 患者术后定期电话或门诊随访3 年，随访截止时间为2022 年12 月31 日或患者死亡；统计患者总生存时间，即从出院后至死亡或随访结束的时间。

1.3 qRT-PCR检测miR-205、miR-367的相对表达量

按TRIzol 试剂盒说明书提取组织总RNA，按mRNA 反转录试剂盒将2 µg RNA 反转录为cDNA，然后按SYBR Green PCR master mix 试剂说明书配置反应体系，加样。反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×） 10 µL、cDNA 2.0 µL、上下游引物各0.8 µL、ROX Reference Dye Ⅱ（50×） 0.4 µL、ddH2O 6.0 µL。荧光定量PCR 反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃15 s，72 ℃ 15 s，共40 个循环，然后72 ℃反应10 min。以GAPDH 为内参。 miR-205 正向引物5' -AG AACTTATACTGAGTGAGG-3'，反向引物5'-GAAGTC AAGATCGAATTG-3'；miR-367 正向引物5'-TTCTCCG AACTTGTCACGTTT-3'，反向引物5'-ACGTGACACGT TCGGAGAATT-3'；GAPDH 正向引物5'-GAAGGTGA AGGTCGCAGTC3'，反向引物5'-GAAGATGGTGATG GGATTTC-3'。反应结束后收集数据，分析获得的Ct值，采用2-△△Ct法计算miR-205、miR-367 的相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用独立样本t检验；计数资料以率（%）表示，采用χ2检验。Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线，采用Log-rank检验分析生存率；COX比例风险回归模型分析预后的影响因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织miR-205、miR-367表达水平的比较

CMM 组患者miR-205 表达水平低于对照组（P＜0.05），miR-367 表达水平高于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 不同组织miR-205、miR-367表达水平的比较（±s）

表1 不同组织miR-205、miR-367表达水平的比较（±s）

组别对照组CMM组n 80 85 tP miR-205 1.02±0.15 0.46±0.07 34.648＜0.001 miR-367 1.12±0.20 2.23±0.53 19.319＜0.001

2.2 患者miR-205、miR-367表达与临床病理特征的关系

以miR-205、miR-367 在CMM 组织中表达水平的均数为临界值，将患者分为miR-205低表达组（≤0.46，52 例）、高表达组（＞0.46，33 例）及miR-367 高表达组（≥2.23，59例）、低表达组（＜2.23，26例）。

miR-205 低表达组患者溃疡、临床分期高、肿瘤侵袭、KPS 评分低、原发灶厚、Clark 分级高、淋巴结转移的比例高于miR-205 高表达组（P＜0.05），miR-367 高表达组患者以上指标比例高于miR-367 低表达组（P＜0.05）；miR-205、miR-367 表达与患者性别、年龄、肿瘤直径无关（P＞0.05），见表2。

表2 患者miR-205、miR-367表达与临床病理特征的关系[例（%）]

2.3 患者生存分析

患者术后随访3 年，中位时间为28.3 个月，失访1 例。Kaplan-Meier生存曲线显示，miR-205 高表达组患者3 年生存率为69.70%（23/33），高于低表达组患者的50.98%（26/51）；miR-367 低表达组患者3 年生存率为69.23%（18/26），高于高表达组患者的53.45%（31/58），差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 Kaplan-Meier生存曲线

2.4 患者预后的影响因素分析

单因素分析显示，临床分期、肿瘤侵袭性、KPS 评分、原发灶厚度、Clark 分级、淋巴结转移、miR-205、miR-367为预后的影响因素（P＜0.05）。COX多因素分析显示，临床分期高、KPS 评分低、Clark 分级高、有淋巴结转移及miR-367 升高为影响患者预后的危险因素（P＜0.05），miR-205 升高为其保护因素（P＜0.05），见表3。

表3 患者预后的单因素与多因素COX比例风险回归分析

3 讨论

CMM 为来源于皮肤黑色素细胞的恶性肿瘤，隐匿性及恶性程度较高，易发生血管、淋巴结转移，且病情发展迅速，严重威胁患者的健康[11-12]。CMM 的临床治疗以手术为主，患者确诊后应尽快行原发灶扩大切除手术，临床分期Ⅲ期的患者在扩大切除的基础上还应实施区域淋巴结清扫；化疗也是其常用的治疗方式，但仅少部分患者对化疗敏感；靶向治疗为近年来快速发展的方法，针对性较强，故CMM 靶向基因突变成为目前临床研究的热点[13]。

miRNAs 为具有基因调节功能的短链非编码RNA，通过转录后抑制调节基因表达，可直接切割mRNA 或直接翻译抑制其目标蛋白编码基因[14]。特定miRNAs 与多种生理、病理过程有关[14]。miRNAs 对癌症的影响取决于其靶基因的功能性质，可分别通过靶基因的功能性质产生抑癌或致癌效果[15]。miR-205 具有调节细胞增殖、迁移和侵袭等多种功能，在癌症中其表达发生改变[7]。当miR-205表达下调时，鉴定其靶基因可能有助于判断CMM 转移扩散的分子途径，该途径可以为阻断CMM的转移提供新的潜在治疗靶点[16]。研究指出，miR-205 在前列腺癌中表达下调，上调其表达后能抑制癌细胞生长、转移等过程[7]。据报道，miR-367 参与了不同癌症的发生和转移，起促癌或抑癌作用[17-18]。研究显示，miR-367 过表达可促进癌细胞的生长，与非小细胞肺癌患者不良预后相关[18]。目前，临床研究中关于miR-205、miR-367 在CMM 中的作用尚不清楚。本研究结果显示，CMM 组患者miR-205表达水平低于对照组，miR-367表达水平高于对照组，提示miR-205、miR-367 与CMM 的发生有关，可能是miR-205、miR-367 参与调控CMM 细胞增殖过程。研究显示，miR-205 能调节细胞增殖、侵袭、转移等多个过程[19]，miR-205 表达下调可促使CMM 的转移扩散，缩短患者的生存时间；miR-367 在CMM 细胞中一个重要的靶点为PTEN，通过靶向PTEN 基因发挥促癌作用，参与癌细胞的增殖、迁移等恶性行为[20]。

本研究结果显示，miR-205、miR-367 表达与患者溃疡、临床分期高、肿瘤侵袭、KPS 评分低、原发灶厚、Clark分级高及淋巴结转移等临床病理特征有关，提示miR-205、miR-367 可能参与CMM 的发生、发展过程；Kaplan-Meier生存曲线显示，miR-205 高表达组患者3 年生存率高于miR-205 低表达组，miR-367 低表达组患者3 年生存率高于miR-367 高表达组，miR-205 升高为患者预后的保护因素，miR-367 升高为患者预后的危险因素，提示miR-205、miR-367 表达与CMM 患者预后有关，推测miR-205 具有抑制肿瘤细胞增殖的作用[21]，miR-205 表达下调介导的机制促进CMM 进展。miR-367 高表达促进细胞增殖、迁移，并抑制其靶基因PTEN表达，促进肿瘤进展，进而导致患者预后不良[22]。提示miR-367 可能通过调节靶基因PTEN 表达以促进CMM发展。

本研究COX回归模型显示，临床分期高、KPS 评分低、Clark 分级高、有淋巴结转移为患者预后的危险因素。研究显示，KPS 评分＜80 分的患者无法独立正常工作，分数越低，其状态越差，预后也较差[23]。Clark分级越高表示浸润程度越深[24]，肿瘤侵袭性越强，转移风险也越大。因此，对于具有以上特征的患者，临床应提前做好风险预防措施。

综上，在CMM 组织中miR-205低表达，miR-367高表达，且与患者溃疡、临床分期低、肿瘤侵袭、KPS评分低、原发灶厚、Clark 分级高及淋巴结转移有关，且miR-205 高表达、miR-367 低表达的患者生存率更高，可作为评估CMM预后的潜在标志物，具体作用机制需结合细胞或动物模型进一步研究。