circDNMT1 调节miR-377-3p/PUM1 轴对三阴性乳腺癌细胞增殖、凋亡和上皮-间质转化的影响

林明利,郑美玲,卢宏全,林耀庭 （. 儋州市人民医院检验科，海南 儋州 57700；. 海南西部中心医院肿瘤内科，海南 儋州 57700；. 儋州市人民医院普外科，海南 儋州 57700）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率持续上升。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)约占乳腺癌的15%，复发率、转移率和病死率最高，且缺乏有效的靶向治疗方案[1]。TNBC 的典型特征是缺乏雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2，因其无有效治疗靶点，治疗有一定局限，且预后较差[2]。因此，寻找新的TNBC 预后标志物和分子治疗靶点十分重要。circRNAs 是一类新型的非编码RNA，其特征是缺乏3'poly(A)尾巴的特殊环状结构[3]。有研究发现，circRNAs 在许多癌症中是关键调节因子，如下调circDDX17可促进结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，并抑制其凋亡[4]。敲低circDNMT1 可抑制乳腺癌细胞集落形成、迁移、侵袭和肿瘤生长，促进细胞凋亡[5]。还有研究发现，circRNA/miRNA/mRNA轴参与TNBC的发展[6]。下调miR-377-3p 会促进TNBC 的进展[7]，而下调PUM1 会抑制TNBC 的进展[8]。但目前circDNMT1 是否可通过调节miR-377-3p/PUM1 轴影响TNBC 的恶性生物学行为尚不清楚。因此，本研究旨在探究circDNMT1 对TNBC 细胞增殖、凋亡、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响及其作用机制，以期为该病的临床诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料

收集儋州市人民医院2018年至2021年收治的24例TNBC 患者的TNBC 组织（TNBC 组）及其邻近正常组织（NOR 组）。本研究经儋州市人民医院医学伦理委员会批准（2018-10099），符合《赫尔辛基宣言》，所有患者均签署对手术的知情同意书。

TNBC 细胞系4T1、Eph41424、JC，正常乳腺上皮细胞系HC11均购自上海酶研生物科技有限公司；si-NC、si-DNMT1、anti-NC、anti-miR-377-3p购自上海生工生物工程股份有限公司；CCK-8试剂盒购自上海吉至生化科技有限公司；PUM1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2抗体均购自英国Abcam 公司。30 只BALB/c 小鼠[体质量（20±2）g]购自广州锐格生物科技有限公司[生产许可证号：SCXK（粤）2021-0059]。

1.2 qRT-PCR检测miR-377-3p、circDNMT1表达

使用TRIzol 试剂提取组织和细胞的总RNA，然后反转录成cDNA。根据qRT-qPCR 试剂盒配制反应体系，然后扩增。反应条件为：95 ℃预变性4 min，95 ℃45 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。以U6或GAPDH 为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算miR-377-3p、circDNMT1的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 4T1细胞转染及分组

将4T1细胞添加至含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM 培养基中，待4T1 细胞培养至75%汇合时，用Lipofectamine 2000试剂盒进行转染，并分为4T1组（未处理的4T1 细胞）、si-NC 组（转染si-NC）、si-DNMT1 组（转染si-DNMT1）、si-DNMT1+anti-NC 组（同时转染si-DNMT1 和anti-NC）、si-DNMT1+anti-miR-377-3p 组（同时转染si-DNMT1 和anti-miR-377-3p）。在细胞培养箱中培养48 h后用于后续检测。

1.4 CCK-8检测4T1细胞增殖水平

将各组4T1细胞按5×103/孔的密度接种至96孔板上，然后在细胞培养0、24、48 h 时向每孔加入10 µL CCK-8 试剂，置于细胞培养箱孵育2 h 后，用酶标仪检测各组4T1 细胞在450 nm 波长处的光密度（optical density，OD）值。

1.5 流式细胞术检测4T1细胞凋亡水平

将各组4T1细胞加入胰酶消化成细胞悬液，用PBS清洗后调整4T1细胞浓度为5×105/mL。取100 µL细胞悬液与10 µL Annexin V-FITC 和10 µL PI 混合，置于4 ℃冰箱孵育15 min，PBS 清洗2 次，随后加入480 µL结合缓冲液重悬4T1 细胞，上机检测细胞凋亡率。细胞凋亡率（%）=（细胞凋亡数目/细胞总数）×100%。

1.6 双荧光素酶报告验证miR-377-3p 与PUM1、circDNMT1的关系

TargetScan 网站预测miR-377-3p 与circDNMT1、PUM1 是否存在结合位点。将含miR-377-3p 结合位点的野生型circDNMT1/PUM1 序列和不含miR-377-3p 结合位点的突变型circDNMT1/PUM1 序列克隆到pmirGLO 载体中，分别命名为WT-circDNMT1、MUT-circDNMT1、WT-PUM1、MUT-PUM1，然后将上述序列与mimic-NC、miR-377-3p mimic共转染到4T1细胞中，分别记为miR-NC+WT-circDNMT1 组、miR-377-3p mimic+WT-circDNMT1 组、miR-NC+MUT-circDNMT1组、miR-377-3p mimic+MUT-circDNMT1 组和miR-NC+WT-PUM1 组、miR-377-3p mimic+WT-PUM1 组、miR-NC+MUT-PUM1 组、miR-377-3p mimic+MUTPUM1 组。培养48 h 后使用双荧光素酶检测系统检测各组4T1细胞的荧光素酶活性。

1.7 Western blot 检测EMT 及凋亡相关蛋白表达

将TNBC 组织和邻近正常组织及各组4T1 细胞经RIPA 裂解缓冲液裂解后提取总蛋白，经凝胶电泳（120 V，蓝色染料到达胶的底端附近时停止电泳）分离蛋白后转移到PVDF膜（200 mA，1 kD约1 min）上，脱脂牛奶封闭，随后加入PUM1（1∶2 000）、E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、Bax（1∶2 000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、Bcl-2（1∶2 000）一抗和GAPDH抗体（1∶2 000），4 ℃下放置过夜后，TBST 清洗3 次，然后加入辣根过氧化物酶标记的IgG 二抗（1∶5 000），在37 ℃下孵育1 h后加入显色剂，用Image J软件量化目的蛋白的灰度值。

1.8 荷瘤小鼠模型验证circDNMT1对4T1移植瘤的影响

将4T1细胞接种至6周龄小鼠腹部脂肪垫（4×105/只），4 d后观察成瘤情况。将小鼠随机分为空白对照组（注射等量生理盐水）、阴性对照组（尾静脉注射si-NC）、DNMT1 沉默组（尾静脉注射si-DNMT1）、联合对照组（尾静脉注射si-DNMT1 和anti-NC）、联合沉默组（尾静脉注射si-DNMT1和anti-miR-377-3p），每组6只。

接种后35 d 麻醉处死小鼠，取出肿瘤组织，称重后于4%多聚甲醛中固定，经石蜡包埋、切片、脱蜡、水化后进行苏木精-伊红染色，显微镜下观察肿瘤形态变化。

1.9 统计学分析

采用SPSS 25.0 统计软件分析数据，数据经Shapiro-Wilk检验符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，2 组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circDNMT1、miR-377-3p、PUM1 在组织和细胞中的表达

与NOR 组比较，TNBC 组组织中circDNMT1、PUM1 表达显著升高（P＜0.05），miR-377-3p 表达显著降低（P＜0.05）；与HC11 细胞比较，JC、Eph41424 及4T1细胞中circDNMT1、PUM1表达显著上调（P＜0.05），miR-377-3p 表达显著下调（P＜0.05），且在4T1 细胞中表达差异最显著，因此本研究选择4T1 细胞进行后续实验，见图1、2。

图1 circDNMT1、miR-377-3p、PUM1在TNBC组织中的表达

图2 circDNMT1、miR-377-3p、PUM1在各细胞中的表达

2.2 circDNMT1、miR-377-3p、PUM1在4T1细胞中的表达

与4T1 组、si-NC 组比较，si-DNMT1 组细胞中circDNMT1 水平以及PUM1 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），miR-377-3p 表达显著升高（P＜0.05）；与si-DNMT1 组、si-DNMT1+anti-NC 组比较，si-DNMT1+anti-miR-377-3p 组细胞PUM1 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），miR-377-3p表达显著降低（P＜0.05），见图3。

图3 circDNMT1、miR-377-3p、PUM1在各组4T1细胞中的表达

2.3 沉默circDNMT1 或miR-377-3p 对4T1 细胞增殖的影响

与4T1 组、si-NC 组比较，si-DNMT1 组细胞24 h、48 h 的OD 值显著降低（P＜0.05）；与si-DNMT1 组、si-DNMT1+anti-NC 组比较，si-DNMT1+anti-miR-377-3p组细胞24 h、48 h的OD值显著升高（P＜0.05），见图4。

图4 各组4T1细胞增殖能力比较

2.4 沉默circDNMT1 或miR-377-3p 对4T1 细胞凋亡的影响

与4T1 组、si-NC 组比较，si-DNMT1 组4T1 细胞凋亡率及Bax、cleaved caspase-3 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与si-DNMT1 组、si-DNMT1+anti-NC 组比较，si-DNMT1+anti-miR-377-3p组细胞凋亡率及Bax、cleaved caspase-3蛋白表达水平显著下降（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），见图5。

图5 各组4T1细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达

2.5 沉默circDNMT1 或miR-377-3p 对4T1 细胞EMT的影响

与4T1 组、si-NC 组比较，si-DNMT1 组4T1 细胞E-cadherin 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与si-DNMT1组、si-DNMT1+anti-NC组比较，si-DNMT1+anti-miR-377-3p 组4T1 细胞E-cadherin 蛋白表达水平显著下降（P＜0.05），N-cadherin、Vimentin 蛋白表达水平显著上升（P＜0.05），见图6。

图6 各组4T1细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达

2.6 circDNMT1靶向调控miR-377-3p/PUM1轴

通过TargetScan 网站预测发现，miR-377-3p 与circDNMT1、PUM1 均存在结合位点，见图7a。与miR-NC+WT-circDNMT1 组比较，miR-377-3p mimic+WT-circDNMT1 组细胞的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；与miR-NC+MUT-circDNMT1 组比较，miR-377-3p mimic+MUT-circDNMT1 组细胞的荧光素酶活性无显著变化（P＞0.05）；与miR-NC+WT-PUM1组比较，miR-377-3p mimic+WT-PUM1 组细胞的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；而与miR-NC+MUTPUM1 组比较，miR-377-3p mimic+MUT-PUM1 组细胞的荧光素酶活性无显著变化（P＞0.05），见图7b、c。

图7 circDNMT1靶向调控miR-377-3p/PUM1轴

2.7 沉默circDNMT1 或miR-377-3p 对4T1 在小鼠体内增殖的影响

与空白对照组、阴性对照组比较，DNMT1 沉默组小鼠肿瘤质量显著减少（P＜0.05）；与DNMT1 沉默组、联合对照组比较，联合沉默组小鼠肿瘤质量显著增加（P＜0.05），见图8a。

图8 沉默circDNMT1或miR-377-3p对4T1在小鼠体内增殖的影响

空白对照组、阴性对照组小鼠肿瘤细胞排列密集，边界清晰；DNMT1沉默组、联合对照组细胞排列疏松，胞核固缩，细胞碎片增多；联合沉默组组小鼠肿瘤细胞排列比较密集，边界趋于清晰，见图8b。

3 讨论

乳腺癌是女性常见的癌症，是全球癌症相关死亡的主要原因之一，而TNBC 是最具侵袭性的亚型之一[1]。TNBC 常见的治疗方法包括手术、化疗、放疗和免疫疗法[9]。然而，由于局部复发和转移的发生率较高，晚期TNBC患者的预后并不理想。因此，亟需寻找新的靶点开发新的有效治疗策略[10]。CircRNAs 具有末端共价连接、稳定性高、组织特异性表达模式等特点，是人类疾病诊断、治疗和预后的理想生物标志物[11]。研究发现，circRNA 可以作为竞争性内源RNA、蛋白质支架或翻译模板，从而在TNBC 中发挥重要作用[12]。此外，上调circDNMT1 可以通过激活自噬来促进乳腺癌的进展[13]，而下调circDNMT1 可以抑制乳腺癌的进展[5]。本研究也发现，circDNMT1 在TNBC 组织和细胞中表达上调，说明circDNMT1 可能具有促进TNBC进展的作用。

上皮标志物E-cadherin 表达降低及间质标志物N-cadherin、Vimentin 表达升高是EMT 的典型特征[14]。细胞增殖和凋亡对于TNBC细胞的生长极其重要，上调促凋亡蛋白Bax、caspase-3和下调抗凋亡蛋白Bcl-2可以促进TNBC细胞凋亡，从而起到治疗效果[15]。本研究结果显示，与4T1 组、si-NC 组比较，si-DNMT1 组细胞miR-377-3p 表达，4T1 细胞凋亡率，Bax、cleaved caspase-3、E-cadherin 蛋白表达水平显著升高，OD 值及Bcl-2、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平均显著降低，提示沉默DNMT1 可抑制4T1 细胞增殖、EMT，促进其凋亡。

hsa_circ_0131242 可以通过海绵化hsa-miR-2682促进TNBC 的进展[16]。而circRNA/miRNA/mRNA 轴在TNBC 中的研究也有报道[17]。本研究通过TargetScan网站预测发现，circDNMT1 与miR-377-3p 存在结合位点。研究显示，下调miR-377-3p 会促进TNBC 的进展[7,18]。本研究结果亦显示，在TNBC 组织和细胞中miR-377-3p 下调，沉默circDNMT1 后miR-377-3p 表达显著升高；且双荧光素酶报告实验显示，circDNMT1与miR-377-3p 存在靶向关系。因此，我们推测沉默circDNMT1 可能通过上调miR-377-3p 来抑制TNBC 的进展。为了进一步验证该猜测，我们对4T1 细胞同时转染si-DNMT1 和anti-miR-377-3p，结果显示，下调miR-377-3p 会逆转沉默circDNMT1 对4T1 细胞增殖、EMT 的抑制作用和对凋亡的促进作用。PUM1 是乳腺癌的生物标志物[19]，下调PUM1会抑制TNBC 的进展[8]。本研究通过双荧光素酶报告实验发现，miR-377-3p 与PUM1 也存在靶向关系，PUM1 在TNBC 组织和细胞中上调，且沉默circDNMT1 后PUM1 蛋白表达水平显著下降，下调miR-377-3p 后PUM1 蛋白表达水平显著上升，表明沉默circDNMT1 可能通过上调miR-377-3p 来抑制PUM1 表达，进而抑制4T1 细胞增殖、EMT，促进细胞凋亡。此外，本研究通过荷瘤小鼠模型验证circDNMT1 对4T1 移植瘤的影响，结果发现，si-DNMT1组小鼠肿瘤质量显著减少，肿瘤细胞排列疏松，胞核固缩，细胞碎片增多，进一步证明circDNMT1 可能是TNBC患者的潜在治疗靶点。

综上，在TNBC 中沉默circDNMT1 可能通过上调miR-377-3p 来抑制PUM1 表达，进而抑制细胞增殖、EMT，促进细胞凋亡。