circTRIM33-12 调控miR-191/DAB2 轴对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及上皮-间质转化的影响

陈 兵,冯 浩,邹成功,唐 辉 （南充市中心医院神经外科，四川 南充 637000）

脑胶质瘤是起源于脑神经胶质细胞的肿瘤，发病率和病死率均较高[1]。目前治疗方案以手术切除为主，并辅以放疗、化疗等。然而脑胶质瘤难以根治，治疗效果欠佳，易复发，患者预后差[2]。因此，迫切需要从分子层面深入研究脑胶质瘤的发病和发展机制[3]。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类由共价闭环形成的新型内源性非编码RNA 分子，有共价闭环的特征和基因调控潜力[4]，没有编码蛋白的能力[5-6]。circRNA 的重要生理功能包括miRNA 海绵、蛋白质翻译和基因表达调节。有研究发现，circRNA 的异常表达在肿瘤的生长、疾病的诊断和治疗等方面发挥了重要的调控与靶向作用[7-8]。circRNA TRIM33-12（circ-TRIM33-12）的下调与肝癌恶性特征显著相关，是影响肝癌患者术后总生存率和无复发生存率的独立危险因素[9]。但circTRIM33-12在脑胶质瘤细胞中的表达和生物学功能目前尚不清楚。研究发现，miR-191在胶质瘤细胞增殖过程中发挥了重要作用[10]；还有研究通过分析胶质瘤细胞中基因表达谱的变化发现，DAB2在胶质瘤细胞中表达上调[11]，表明miR-191与DAB2 在胶质瘤发展中发挥了关键作用。有研究报道，在肝癌细胞中，circTRIM33-12与miR-191具有直接的靶向作用[11]；在乳腺癌细胞中，miR-191 与DAB2 具有靶向作用[12]。但在脑胶质瘤细胞中，是否通过相同的作用靶点发挥作用尚不清楚，需要进一步研究。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是细胞发育过程中的生理性重编程现象，在此过程中，上皮细胞获得间质细胞的特征，细胞运动性和迁移能力增强，与脑胶质瘤的发生发展密切相关，激活EMT 是脑胶质瘤转移的关键过程[13]。因此，本研究旨在分析circ-TRIM33-12 通过miR-191/DAB2 轴对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡和EMT的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要细胞和试剂

脑胶质瘤细胞CHG-5、人正常脑胶质上皮细胞HEB 购自上海弘顺生物科技有限公司，SYBR Premix Ex Taq试剂盒购自日本TaKaRa公司，点突变试剂盒购自北京赛百盛基因技术有限公司，siRNA NC、circ-TRIM33-12 siRNA、miR-191 inhibitor、miR-191 mimics、DAB2 siRNA 等质粒由上海Genepharma 公司合成，双荧光素酶活性检测试剂盒、RIPA 裂解液购自英国Abcam 公司，DMEM 培养基购自美国Gibco 公司，Turbofect购自美国Invitrogen公司。

1.2 细胞培养及细胞转染

CHG-5 细胞和HEB 细胞使用DMEM 培养基于37 ℃、5% CO2的培养箱中生长并传代培养。显微镜下观察CHG-5 细胞密度为70%～80%时，加入10% 胎牛血清的DMEM 稀释细胞并接种于12 孔板，Turbofect 试剂进行细胞转染，收集各组细胞进行后续实验。实验分组：①siRNA NC 组、circTRIM33-12 siRNA 组、DAB2 siRNA 组；②mimics NC 组、miR-191 mimics 组；③circ-TRIM33-12 WT+mimics NC 组、circTRIM33-12 WT+miR-191 mimics组、circTRIM33-12 MUT+mimics NC组、circTRIM33-12 MUT+miR-191 mimics组；④inhibitor NC组、miR-191 inhibitor 组；⑤pcDNA+mimics NC 组、pcDNA-TRIM33-12+mimics NC 组、pcDNA+miR-191 mimics 组、pcDNA-TRIM33-12+miR-191 mimics 组；⑥DAB2 WT+mimics NC组、DAB2 WT+miR-191 mimics组、DAB2 MUT+mimics NC 组、DAB2 MUT+miR-191 mimics组。

1.3 CCK-8测定CHG-5细胞活力

CHG-5 细胞用含10% 胎牛血清的DMEM 稀释，置于96 孔板上，在37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育，用Turbofect 转染试剂转染各组质粒细胞。于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养48 h 后每孔加入10 µL CCK-8 溶液，常规孵育4～6 h后，在450 nm 波长处检测每孔细胞的光密度（optical density，OD）值。

1.4 双荧光素酶报告基因实验检测荧光素酶活性

TargetScan 预 测 circTRIM33-12 与 miR-191、miR-191 与DAB2 的结合位点。构建circTRIM33-12 WT、DAB2 WT、circTRIM33-12 MUT 和DAB2 MUT 载体。通过Turbofect将circTRIM33-12 WT、circTRIM33-12 MUT 分别与miR-191 mimics、mimics NC 质粒，DAB2 WT、DAB2 MUT 分别与miR-191 mimics、mimics NC 共转染至CHG-5 细胞，并进行双荧光素酶报告基因活性检测。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率

CHG-5细胞进行质粒转染，培养48 h后以900 r/min离心5 min，用PBS清洗沉淀3次，细胞稀释至1×106/mL，加入5 µL Annexin V-FITC 和10 µL PI，轻轻混匀后在暗室中孵育15 min，每管加入400 µL 1×Binding Buffer后检测细胞凋亡情况。

1.6 RT-qPCR检测相关基因表达

TRIzol 试剂提取各组细胞总RNA，使用Prime-ScriptTMIV 1st Strand cDNA Synthesis Mix 试剂盒说明书将RNA 反转录成cDNA。以cDNA 为模板，配置相应的体系，每组设置3个复孔，进行RT-qPCR。反应条件：42 ℃ 2 min；37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，39 个循环。实验结果采用2-△△Ct法分析。所用引物序列见表1。

表1 引物序列

1.7 Western blot检测蛋白表达

收集细胞，加入蛋白裂解液进行蛋白裂解，使用BCA 法测定蛋白浓度，然后进行SDS-PAGE 凝胶电泳，浓缩胶75 V 30 min，分离胶120 V 90 min。将蛋白在80 V 湿转2 h 到PVDF 膜上，室温封闭3 h 后，将PVDF膜和特异性一抗在4 ℃孵育12 h，与相应二抗置于室温孵育90 min，清洗5 次，滴加ECL 反应液进行蛋白显影，以GAPDH 为内参，计算E-cadherin和N-cadherin表达量。

1.8 统计学处理

采用Graphpad prism 软件处理数据。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHG-5 细胞和HEB 细胞中circTRIM33-12、miR-191、DAB2的表达

RT-qPCR结果显示，HEB细胞中的circTRIM33-12、DAB2 mRNA 表达高于CHG-5 细胞，miR-191 表达低于CHG-5细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 各细胞中circTRIM33-12、miR-191、DAB2 mRNA表达

2.2 下调circTRIM33-12 表达对CHG-5 细胞增殖、凋亡及EMT的影响

siRNA NC 组CHG-5 细胞circTRIM33-12 表达高于circTRIM33-12 siRNA 组（P＜0.01），见图2a。流式细胞仪检测结果显示，circTRIM33-12 siRNA 组CHG-5细胞凋亡率明显低于siRNA NC 组（P＜0.01），见图2b。下调circTRIM33-12 表达促进了CHG-5 细胞增殖（P＜0.05），见图2c。Western blot 结果显示，下调circ-TRIM33-12 表达后，N-cadherin 表达升高（P＜0.01），而E-cadherin表达降低（P＜0.01），见图2d。

图2 下调circTRIM33-12表达对CHG-5细胞增殖、凋亡及EMT的影响

2.3 circTRIM33-12 与miR-191 靶向关系的预测和验证

circTRIM33-12 可与miR-191 靶向结合（图3a）。RT-qPCR 结果显示，mimics NC 组与miR-191 mimics 组中miR-191 表达比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，见

图3 circTRIM33-12与miR-191结合位点的预测和验证

2.4 miR-191影响CHG-5细胞的增殖、凋亡及EMT

CCK-8 实验结果显示，miR-191 inhibitor 组CHG-5细胞增殖能力明显低于inhibitor NC 组(P＜0.05)，见图4a。Western blot 结果显示，下调miR-191 表达后，E-cadherin 表达升高（P＜0.01），N-cadherin 表达降低（P＜0.01），见图4b。流式细胞仪检测结果表示，miR-191 inhibitor 组CHG-5 细胞凋亡率明显高于inhibitor NC组(P＜0.05)，见图4c。

图4 miR-191影响CHG-5细胞的增殖、凋亡及EMT

2.5 上调circTRIM33-12 通过miR-191 对CHG-5 细胞增殖、凋亡及EMT的影响

pcDNA-TRIM33-12+mimics NC 组CHG-5 细胞中circTRIM33-12表达显著高于pcDNA+mimics NC 组，差异有统计学意义(P＜0.05)。与pcDNA+mimics NC 组相比，pcDNA-TRIM33-12+mimics NC 组CHG-5 细胞增殖图3b。双荧光素酶报告基因检测结果显示，与circ-TRIM33-12 WT+mimics NC 组比较，circTRIM33-12 WT+miR-191 mimics 组荧光素酶活性显著降低(P＜0.01)；与circTRIM33-12 MUT+mimics NC 组比较，circTRIM33-12 MUT+miR-191 mimics 组荧光素酶活性变化差异无统计学意义(P＞0.05)，见图3c。能力和N-cadherin表达降低（P＜0.01），E-cadherin表达和细胞凋亡率升高(P＜0.05)；而pcDNA+miR-191 mimics 组CHG-5 细胞增殖能力和N-cadherin 表达升高（P＜0.01），E-cadherin 表达和细胞凋亡率降低(P＜0.01)。与pcDNA+miR-191 mimics 组相比，pcDNATRIM33-12+miR-191 mimics 组CHG-5 细胞增殖能力和N-cadherin表达降低（P＜0.01），E-cadherin表达和细胞凋亡率上升(P＜0.01)，见图5。

图5 上调circTRIM33-12通过miR-191对CHG-5细胞增殖、凋亡及EMT的影响

2.6 miR-191与DAB2之间的关系

miR-191 可与DAB2 靶向结合（图6a）。双荧光素酶报告基因检测结果显示，DAB2 WT+miR-191 mimics组细胞荧光素酶活性低于DAB2 WT+mimics NC 组(P＜0.01)；与DAB2 MUT+mimics NC 组比较，DAB2 MUT+miR-191 mimics 组细胞荧光素酶活性无变化(P＞0.05)，见图6b。

图6 miR-191与DAB2结合位点的预测和验证

2.7 下调DAB2表达对CHG-5细胞增殖、凋亡及EMT的影响

与siRNA NC 组相比，DAB2 siRNA 组CHG-5 细胞增殖活力升高（P＜0.05），见图7a。Western blot结果显示，下调DAB2 后，E-cadherin 表达降低（P＜0.05)，N-cadherin 表达升高（P＜0.05），见图7b。流式细胞仪检测结果表示，与siRNA NC 相比，DAB2 siRNA 组CHG-5细胞凋亡率明显降低（P＜0.05），见图7c。

图7 下调DAB2表达对CHG-5细胞增殖、凋亡及EMT的影响

2.8 上调circTRIM33-12 靶向miR-191 对DAB2 表达的影响

RT-qPCR 结果显示，pcDNA-TRIM33-12+mimics NC 组中DAB2 表达明显高于pcDNA+mimics NC 组(P＜0.01)，表明circTRIM33-12 与DAB2 存在正调控关系。与pcDNA+mimics NC 组比较，pcDNA+miR-191 mimics 组DAB2 表达降低(P＜0.01)，表明miR-191 与DAB2 存在负调控关系。pcDNA-TRIM33-12+miR-191 mimics 组中DAB2 表达明显高于pcDNA+miR-191 mimics 组(P＜0.01)，表明circTRIM33-12 能够通过miR-191调控DAB2表达，见图8。

图8 RT-qPCR检测circTRIM33-12靶向miR-191对DAB2表达的影响

3 讨论

目前，circRNA 在肿瘤发生和进展中的作用已引起广泛关注。有研究报道，circMTO1是肝癌细胞中通过miR-9发挥作用的肿瘤相关分子[14]；circBCBM1 通过调控miR-125a/BRD4 轴促进乳腺癌脑转移[15]；circDLGAP4通过调控microRNA-143/CDK1 轴参与肺癌的发展[16]。因此，circRNA 可能作为具有特异性的生物标志物用于癌症的临床诊断。为了研究circTRIM33-12 在脑胶质瘤细胞中的表达和生物学功能，本研究采用RT-qPCR 检测脑胶质瘤细胞和正常脑胶质细胞中circTRIM33-12 的表达水平，结果显示，circTRIM33-12在CHG-5 细胞中的表达明显降低。circTRIM33-12 的异常表达提示该分子可能参与脑胶质瘤的发展。研究表明，EMT 参与肿瘤的侵袭和转移，在癌细胞EMT过程中，E-cadherin 和β-catenin 表达降低[17]，而间质标志物N-cadherin、Vimentin 及fibronectin 表达增高[18]。因此，可以通过检测EMT 相关蛋白表达来反映肿瘤的发展进程。本研究结果显示，circTRIM33-12能够促进CHG-5 细胞增殖和EMT，抑制细胞凋亡，提示circTRIM33-12 在脑胶质瘤细胞中发挥抑癌作用。Zhang 等[11]的研究表明，circTRIM33-12 在肝癌进展中发挥了明显的抑癌作用，本研究结果与之一致，且本研究揭示了circTRIM33-12在脑胶质瘤中的作用机制，为进一步深入了解脑胶质瘤的致病机理提供了新的方向。

本研究发现，miR-191 能够识别circTRIM33-12 并与之结合，但不会促进circTRIM33-12 的降解。miR-191 是一种癌基因，在乳腺癌中表达上调，参与调控乳腺癌发展[19]；同时，miR-191 可通过TET1 介导的APC 表观遗传调控子宫内膜癌细胞生长[20]；另外，miR-191 还与宫颈癌恶性转化有关[21]。本研究结果显示，miR-191 在胶质瘤细胞CHG-5 中发挥了明显的癌基因功能；Xue 等[9]研究表明，miR-191 通过直接靶向NDST1 在原发性胶质母细胞瘤中发挥癌基因的作用，本研究结果与之相符，进一步证实了miR-191 在胶质瘤发展中的关键作用。此外，本研究还发现，过表达circTRIM33-12 通过下调miR-191 表达抑制CHG-5 细胞的增殖和EMT，并诱导癌细胞的凋亡，进一步表明circTRIM33-12 对CHG-5 细胞增殖、凋亡及EMT 的调控作用是通过其作用靶点miR-191实现的。有研究表明，miR-191 在癌细胞中可能通过mRNA 发挥作用，如miR-191 通过靶向DICER1 促进乳腺癌细胞增殖和转移[22]。miR-19a-3p 通过PTEN 调节人胃癌细胞增殖水平[23]。本研究发现，DAB2 3'UTR 与miR-191 特异性结合，且DAB2 在CHG-5 细胞中表达降低。DAB2 又称DOC2，是卵巢癌中的抑癌基因。越来越多的证据表明，DAB2 在结直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、食管鳞状癌和乳腺癌中亦表达下调[12，24-25]。如DAB2 在子宫内膜癌组织中表达下调，与肿瘤组织分化及细胞增殖迁移有关[26]。DAB2 通过调节Wnt/β-catenin 和Hippo-YAP信号通路抑制胃癌细胞迁移[27]。然而，目前DAB2 在脑胶质瘤细胞中的生物学功能还尚不明确。本研究结果表明，下调DAB2 显著提高了脑胶质瘤细胞CHG-5 的细胞活力，抑制了癌细胞凋亡。同时，circTRIM33-12 能够通过miR-191 调控DAB2 表达。本研究中DAB2 在脑胶质瘤中发挥的抑癌作用与其在前列腺癌、膀胱癌等肿瘤中发挥的作用一致，进一步丰富了DAB2 的生物学功能，为脑胶质瘤患者提供了一个潜在的诊断生物标志物，也为改善脑胶质瘤患者的不良预后提供了理论基础。

综上，本研究揭示了circTRIM33-12在脑胶质瘤细胞中通过miR-191/DAB2 轴调控脑胶质瘤细胞增殖、凋亡和EMT。