增强拉曼光谱法快速筛查尿液中的芬太尼类物质的研究

＊陈海云 林晓 凌伟航 苏院司 滕丽琼

（南宁壮博生物科技有限公司 广西 530007）

芬太尼是一种强效合成阿片类物质，具有阵痛等麻醉药理作用，与吗啡类似，但药效约是吗啡的75～100倍[1]。过量使用芬太尼可导致嘴唇发青、呼吸困难、口吐泡沫、身体僵硬，芬太尼的剂量低至2mg就可能致命。芬太尼的相似物极多，其母体包含两个苯环与一个哌啶环，极易被取代，因此也被称为“设计家药物”，且芬太尼本身荧光干扰强，对现场检测干扰较大[2]。

芬太尼类物质的结构相似度较高，可以通过检测芬太尼类物质共有的官能团进行识别，再根据取代基的不同进行细分[3]。目前，芬太尼类物质的检验方法主要有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱串联质谱法、酶联免疫吸附测定法、拉曼光谱法、红外光谱法等[4]。拉曼增强技术作为一项新兴的分子光谱技术，可以准确检测待测物的分子结构[5]。相较常规拉曼，增强技术（SERS）克服其它光谱技术（常规拉曼、红外、紫外-可见光等）难以检测微痕量物质的缺点，将目标物信号增大百万倍以上，并且不受水和环境气体信号影响，同时保留其它光谱技术快速、简便的优点[6]。

本文主要记录了用拉曼技术在人体尿液中检测芬太尼类新精神活性物质和标准品检测的实验过程，并对其实验结果进行了分析。

1.实验部分

(1)实验仪器及条件

实验仪器：壮博JD-1000手持式拉曼光谱仪（南宁壮博生物科技有限公司研究团队研制），激光光源785nm，激光功率250mW，积分时间600ms。壮博JD-1000手持式拉曼光谱仪与市售拉曼光谱仪对比，壮博JD-1000手持式拉曼光谱仪建设有更为全面的尿液中毒品数据库，并有拥有自身的光谱识别算法和云平台比对数据，市售的大多数拉曼仪器建立的是标准品比对数据库，并不符合本试验要求。

(2)实验材料

实验以苄基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼（南京药科大学）；表面增强拉曼检测试剂盒（管制非药用类麻醉、精神类药品）（南宁壮博生物科技有限公司）；人体尿样（南宁壮博生物科技公司）；氯金酸、柠檬酸三钠（国药集团化学试剂有限公司)。

(3)实验方法

①金纳米Au@TRM材料制备。将100mL 0.01% HAuCl3溶液加热至沸腾，加入1mL 1%的柠檬酸钠溶液作为还原剂，磁力搅拌30min，冷却后即得纳米金溶胶，在纳米金溶胶中再加入一定浓度的秋兰姆溶液，混匀后常温孵化一定时间，离心浓缩至10mL，再加入90mL复溶液复溶。将制备好的溶胶冷却至室温，于4℃下避光储存。

②样品制备。分别将4种芬太尼加入到人工尿样中，制备成苄基芬太尼浓度为0.5mg/kg、丙烯酰芬太尼浓度为0.5mg/kg、硫代芬太尼浓度为0.5mg/kg、乙酰芬太尼浓度为1mg/kg的模拟尿样。标准品苄基芬太尼用水稀释到浓度为0.5mg/kg、丙烯酰芬太尼用水稀释到浓度为0.02mg/kg、硫代芬太尼用水稀释到浓度为0.05mg/kg、乙酰芬太尼用水稀释到浓度为1mg/kg进行检测。

③标准品检测。进行检测时，将激光头的激光出射口对准检测瓶，检测瓶中加入待检验品，按下手机界面的“检测”按扭，采数秒信号后；如果鉴别结果是危险品，则给出匹配物质名称并震动报警。使用表面增强拉曼检测试剂盒对样品进行检测。

空白检验：取100μL去离子水，加入100μL增强试剂，立即用拉曼光谱仪器在目标物检测模式下标准品M1库中检测，平行操作4份。取100μL水溶液，加入100μL增强试剂，用拉曼光谱仪器在目标物检验模式下检测，重复检测4次。

样品检验：取100μL苄基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼水溶液，加入100μL增强试剂，用拉曼光谱仪器在目标物检验模式下检测，重复检测4次。

④尿液中掺标准品检测。空白尿液检测：取4份400 μL空白尿液样品，按试剂盒产品说明书中方法进行处理，供配套拉曼光谱仪器目标物检验模式下进行目标物识别检测。重复检测4次。

尿液中掺标物检测：取4份400 μL苄基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼尿液添加样品，按产品试剂盒说明书中方法进行前处理再加入100μL增强试剂，供配套拉曼光谱仪器目标物检验模式下进行目标物识别检测，重复检测4次。

2.结果与讨论

(1)标准品检测结果

通过表面增强拉曼试剂，可以将照射到芬太尼类物质表面的信号大大增强，从而辨别出不同芬太尼的峰值特征，拉曼测定的是分子受激发后的反射光，因此对于有些物资如无定型的物质玻璃等会在测定中产生强烈的荧光干扰，将拉曼信号掩盖[7]。所以需要增强试剂增强目标物的反射光，放置被荧光干扰或者掩盖，就结论而言，增强试剂很好的帮助目标物增强了反射光，提供了良好的信号。通过多峰判断对比出具体物质。苄基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼标准品，实验结果如图1所示。徐琳，何洪源等人[8]研究了28种芬太尼的拉曼光谱，发现在拉曼光谱中，芬太尼类物质均在1000cm-1处有强的拉曼峰，该峰是由苯环上C-H键的面内弯曲振动引起的[8]。对应我们检测出的4种芬太尼都出现的位移在996cm-1处的峰。此处的峰为基峰，其他峰的强度均低于基峰强度的30%。仅凭996cm-1这条峰无法确证为芬太尼类物质。故需要对各类芬太尼类物质进行具体分析其特征峰归属，其对应的拉曼峰见表1。从这些特征峰数值和位移情况可以看出，拉曼光谱对于芬太尼类物质具有高的区分度，但对于部分结构上相差一个甲基的结构类似物或甲基取代基不同的同分异构体的区分度较弱。

表1 苄基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼的拉曼特征峰数值表

图1 苄基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼的光谱对比图

(2)尿液中掺标检测结果

芬太尼样品在尿液中含有的有机物过多有较强的的干扰，利用试剂盒进行前处理并添加了增强试剂后能够有效的避免干扰，读取有效明显的特征峰。通过比对，能够很明显的发现，拉曼激光明显会受到环境或者其他因素干扰（图2）。

图2 苄基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼在尿液中检出的光谱对比图

①标准品与尿液中掺标光谱比对

芬太尼样品在尿液中和标准品检测读取有效明显的特征峰。通过比对，能够发现，有部分拉曼位移轻微有些变化，其特征峰数值变动范围在1～5之间。对于苄基芬太尼拉曼光谱图，其695cm-1、739cm-1、824cm-1、911cm-1、996cm-1、1022cm-1、1166cm-1、1209cm-1特征峰作为特征识别依据在尿液中和标准品特征峰一致，其特征峰数值偏移为0，完全一致；对于乙酰芬太尼，其中996cm-1特征峰作为特征识别依据在尿液中和标准品一致，其743cm-1、826cm-1、918cm-1、1024cm-1、1069cm-1、1202cm-1为尿液中乙酰芬太尼的特征峰，对比标准品特征峰741cm-1、824cm-1、915cm-1、1022cm-1、1170cm-1、1198cm-1数值变动范围为2～4，拉曼位移偏移数值在5以内为正常偏移，所以根据尿液中乙酰芬太尼与标准品乙酰芬太尼特征峰判别，无杂峰、图谱一致，识别为同一物质；尿液中丙烯酰芬太尼1019cm-1、1251cm-1特征峰对比标准品特征峰1021cm-1、1249cm-1，其特征峰数值变动范围为3，为正常偏移，所以根据尿液中丙烯酰芬太尼与标准品丙烯酰芬太尼特征峰判别，无杂峰、图谱一致，可识别为同一物质；对于硫代芬太尼，551cm-1、996cm-1、1068cm-1特征峰为两种状态共同特征识别依据，尿液中硫代芬太尼739cm-1、800cm-1、909cm-1、1023cm-1、1162cm-1、1414cm-1特征峰对比硫代芬太尼标准品特征峰742cm-1、802cm-1、911cm-1、1021cm-1、1164cm-1、1412cm-1，其特征峰数值变动范围为2～3，也为正常偏移，所以根据尿液中硫代芬太尼与标准品硫代芬太尼特征峰判别，无杂峰、图谱一致，可识别为同一物质。

3.结论

本文基于拉曼增强技术对水溶液和尿液中的苄基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼进行研究。通过实验值对比，分析了4种芬太尼的拉曼光谱特征。在实战时，对样品进行前处理后，排除杂质和荧光干扰条件下，证明利用增强拉曼技术可有效检测出低痕量芬太尼类物质，绝大多数的芬太尼类结构类似物都明显具有区分度。由于芬太尼类物质种类多且人体吸食后代谢研究难度大，所以芬太尼类物质在生物体内经过代谢后尿液中的药物浓度的确切含量还在不断研究中，尚不能定论是怎样的数值。本次试验的检出限对比液相色谱仪能检出的检出限来看偏高，还需进行更多的试验去验证该方法在警方实战过程中的有效性。且本文利用拉曼技术检测人体尿液中芬太尼的试验由于没有大量吸食芬太尼的人员尿液，所以本试验是在正常人体尿液中掺入的芬太尼类物质的低浓度标准品，实际应用时可能出现假阴性或者假阳性的结果，验证实际应用情况，需要在警方的支持下才能更好的完成试验[9-10]。

总的来说，该方法具有快速、准确、无损、操作简便等优点，为水溶液中和尿液中苄基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼的快速检测打下了良好的基础。