卷丹百合根腐病植株与健康植株根际土壤真菌群落结构差异

2024-01-22肖才升赵瑞元

西南农业学报 2023年11期

贺璐,马杰,傅淋,肖才升,刘芳,赵瑞元,李庠

(1.湖南省棉花科学研究所,湖南常德 415101;2. 湖南应用技术学院,湖南常德 415100)

【研究意义】卷丹百合(Liliumlancifolium)为百合科植物[1],是《中国药典》(2020版)规定的百合药材基源植物之一,也是湖南省百合种植的主要品种之一,主要分布在湘西龙山,具有养阴润肺、清心安神的功效。现代药理学研究表明,卷丹百合含多糖、多酚、香豆酸、没食子酸、皂苷、黄酮等多种成分,具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、增强免疫等药理作用[2-6]。卷丹百合兼具药用、食用、观赏等多种价值,综合利用价值较高。目前市场上卷丹百合供给主要依靠人工种植,然而在种植过程中易受病害肆虐,严重影响产量和质量。百合根腐病又称枯萎病、茎腐病,是由土传真菌引发的一类严重土传病害[7],主要由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、茄腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)和串珠镰刀菌(Fusariummoniliform)3种病原菌侵染发病,也与连作、害虫、土壤pH、栽培管理方法及其他环境因素等相关[8-10]。植物根际微生物在促进植物生长、参与营养转化及抑制病害的发生等方面发挥重要作用。因此,研究健康百合与患根腐病百合根际真菌多样性及群落结构组成差异,对进一步探究百合根腐病与根际真菌之间的关系,筛选根腐病生防菌具有重要意义。【前人研究进展】真菌是土壤生态系统中的重要分解者,通常与环境中有机质的分解和养分循环和能量传递有关,其多样性、群落结构与功能被认为是评价生态系统稳定和环境可持续性的重要指标之一。根际真菌在根际生态系统中的主要作用体现在两个方面：一是作为致病菌引起作物土传病害的发生,引起连作障碍,导致作物减产;另一方面可作为生防菌对作物土传病害的防治发挥着重要作用[11-12]。前人采用高通量技术对北苍术[13]、枸杞[14]、烤烟[15]、黄精[16]等作物患根腐病植株根际土壤微生物多样性进行分析,结果表明各作物患根腐病的植株根际土壤真菌的群落结构和多样性与健康植株相比存在较大差异,毛壳属(Cheatomium)、Schizotheciumj在健康北苍术根际土壤中丰度更高,致病菌镰刀菌(Fusarium)在根腐病北苍术、枸杞根际土壤中丰度更高;茄镰刀菌(F.solani)、棘孢木霉(Trichodermaasperellum)和青霉菌(Penicilliumraperi)在根腐病烤烟植株根际土壤中比健康烟株根际土壤中丰度高。目前,针对百合病害的研究主要集中在病原菌分离与鉴定、拮抗菌筛选、发病机理及防治技术等方面,但都是针对龙牙百合、兰州百合等品种。如李润根等[17]首次报道层出镰孢菌(Fusariumproliferatum)能够引发龙牙百合枯萎病,杨谢斌[18]发现枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)对百合枯萎病病原菌有较好的抑制作用,张铭顺[19]发现康宁霉素可以有效地防治百合根腐病,低浓度的康宁霉素对百合植株具有较好促生作用。【本研究切入点】现有关于卷丹百合病害的研究主要是灰霉病、黑斑病的病原菌筛选以及综合防治技术,根际微生物群落方面的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】以湖南省龙山县多年连作地块的健康与患根腐病卷丹百合为对象,研究两者之间根际土壤中真菌的多样性及群落结构差异,为进一步探明卷丹百合根腐病的微生态发病机理和生防菌的筛选及应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 根际土壤样品采集

样品采集于湖南省湘西土家族苗族自治州龙山县(卷丹百合主产区)卷丹百合种植地(109°25′ E, 29°23′ N),海拔484.13 m,年平均气温15.8 ℃,年降雨量1400 mm。采集3组根际土壤样品：健康卷丹百合根际土壤、患根腐病卷丹百合根际土壤、距离采集点约50 m未种过卷丹百合的土壤,每组各采集4份样品,分别编号为LHS1～4、LDS1～4、NS1～4。百合植株取样采用随机取样法,取附着于根系的土壤作为根际土壤;取距离采集点约50 m未种植过百合的空地15～20 cm土壤为空白土壤。将采集的土壤过80目筛,去除杂质,装入无菌离心管,置于冰盒中带回实验室。

1.2 DNA提取、PCR扩增及检测

使用德国Qiagen公司的DNeasy Power Soil Pro Kit试剂盒提取土壤基因组DNA,具体方法参照说明书。采用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度。以合格的DNA为模板,ITS5F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)、ITS1R(5′-GC TGCGTTCTTCATCGATGC-3′)为引物,扩增真菌ITS1序列。扩增体系(25 μL)：5×reaction buffer 5 μL, 5×GC buffer 5 μL, dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL, Forward primer(10 μmol/L)1 μL, Reverse primer(10 μmol/L)1 μL, DNA Template 2 μL, dd H2O 8.75 μL,Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。扩增条件： 98 ℃预变性 2 min;98 ℃变性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,25个循环; 72 ℃ 5 min。扩增产物回收纯化后,由上海派森诺生物科技有限公司进行Illumina Miseq测序。

不同小写字母表示0.05水平上差异显著。Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05.图1 卷丹百合根腐病植株与健康植株根际土壤真菌α多样性分析Fig.1 Alpha diversity of rhizosphere soil fungi between root rot plants and healthy plants of L.lancifolium

1.3 数据分析

对测序得到的原始数据利用DADA2方法进行去引物,质量过滤、去噪、拼接和去嵌合体等处理,质控后产生的每个去重序列称为ASVs(Amplicon sequence variants)。采用R语言进行PCA分析,以量化展示样本间物种组成的差异程度。利用LEfSe (LDA effect size)分析直接对属水平进行差异分析并寻找分组之间的标志物种。用SPSS 21.0对多样性指数及相对丰度进行统计分析,P<0.05代表差异有统计学意义。用Excel作各分类水平菌群结构组成图及α多样性分析图。

2 结果与分析

2.1 卷丹百合根腐病与健康植株根际土壤真菌α多样性分析

利用Illumina平台对真菌ITS-V1区进行测序,共获得876 022条有效序列,经过序列去噪和聚类后,每个样本获得的高质量序列数超过60 000个reads,比例超过94%,且随着抽平深度的增加,稀疏曲线趋于平缓,说明测序效果理想,测序深度足以支持后续分析。Chao1指数、Pielou’s evenness指数和Simpson指数用来反映卷丹百合根际土壤真菌丰富度、均匀度和多样性。从图1可知,根腐病百合根际真菌Chao1指数、Simpson指数与健康百合、空白土壤相比无显著差异,Pielou’s evenness指数显著低于空白土壤(P=0.02),与健康百合相比无显著差异。综上,患根腐病卷丹百合与健康百合根际真菌群落α多样性无显著差异。

2.2 卷丹百合根腐病与健康植株根际土壤真菌群落组成分析

门水平上(图2-A),卷丹百合根际真菌共检测到9个菌门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、Mortierellomycota、毛霉门(Mucoromycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、罗兹菌门(Rozellomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、捕虫霉门(Zoopagomycota)、梳霉门(Kickxellomycota);其中健康百合、患病百合根际及空白土壤优势菌门均为子囊菌门,相对丰度分别为54.35%、79.04%和38.80%,与空白土壤相比,健康百合与患病百合根际子囊菌门的相对丰度分别高15.55%、40.24%,且患病百合根际比健康百合根际高24.69%;油壶菌门(Olpidiomycota)只在空白土壤中检测到。

纲水平上(图2-B),卷丹百合根际土壤和空白土壤中相对丰度最高的为子囊菌纲(Sordariomycetes),健康百合(P=0.035)和患病百合(P=0.007)根际中子囊菌纲的相对丰度显著高于空白土壤,且患病百合比健康百合高8.3%;患病百合根际土壤中散囊菌纲(Eurotiomycetes)的相对丰度显著高于健康百合根际土壤(P=0.005)和空白土壤(P=0.002),健康百合根际土壤和空白土壤无显著差异;百合根际土壤中座囊菌纲(Dothideomycetes)的相对丰度显著低于空白土壤(P=0.001);健康百合根际土壤中银耳纲(Tremellomycetes)的相对丰度显著低于患病百合(P=0.025)和空白土壤(P=0.004)。毛霉纲(Mucoromycetes)在空白土壤、健康百合根际土壤和患病百合根际土壤中的相对丰度分别为1.66%、6.24%、0.17%。

目水平上(图2-C),百合根际土壤和空白土壤中丰度最高的为肉座菌目(Hypocreales),在空白土壤、健康百合根际土壤和患病百合根际土壤中的相对丰度分别为17.70%、27.25%、27.79%;刺盾炱目(Chaetothyriales)在健康百合和患病百合根际土壤中的相对丰度显著高于空白土壤,且在患病百合根际土壤中显著高于健康百合根际土壤(P=0.000);银耳目(Tremellales)在健康百合根际土壤中的相对丰度显著低于患病百合根际(P=0.026)和空白土壤(P=0.002);鸡油菌目(Cantharellales)在健康百合根际土壤和患病百合根际土壤中比空白土壤分别高2.64%、5.24%,患病百合根际土壤比健康百合根际土壤高2.60%;未分类真菌在空白土壤中的相对丰度显著高于患病百合根际土壤(P=0.02)。

科水平上(图2-D),透孢黑团壳科(Massarinaceae)、毛霉菌科(Mucoraceae)只在健康百合和患病百合根际土壤中被检测出;在空白土壤中,肉座菌科(Hypocreaceae)(P=0.043)的相对丰度显著高于健康百合根际土壤,Trimorphomycetaceae(P=0.000,P=0.002)的相对丰度显著高于健康百合和患病百合根际土壤,未分类真菌(P=0.006)的相对丰度显著高于患病百合根际土壤,小疱毛壳科(Her-potrichiellaceae)的相对丰度显著低于健康百合和患病百合根际土壤(P=0.031,P=0.000);患病百合根际土壤中小疱毛壳科的相对丰度显著高于健康百合根际土壤(P=0.031),未分类真菌的相对丰度显著低于健康百合根际土壤(P=0.031)。丛赤壳科(Nectriaceae)、透孢黑团壳科、发菌科(Trichocomaceae)的相对丰度在患病百合根际土壤中比健康百合根际土壤分别高12.87%、10.54%、4.60%。

属水平上(图2-E),丰度前10的真菌属类中,节菱孢属(Saccharicola)、Saitozyma、Thozetella只在健康百合和患病百合根际土壤中检测到;外瓶霉属(Exophiala)的相对丰度在健康百合根际土壤中显著低于患病百合根际土壤(P=0.001),显著高于空白土壤(P=0.019);在空白土壤中,木霉属(Trichoderma,P=0.043)、篮状菌属(Talaromyces,P= 0.04)的相对丰度显著高于健康百合根际土壤,未分类真菌显著高于患病百合根际土壤(P=0.022),Ilyonectria的相对丰度显著低于健康百合根际土壤(P=0.039),Saitozyma的相对丰度显著高于健康百合和患病百合根际土壤(P=0.002)。

综上,卷丹百合根际土壤中子囊菌门、散囊菌纲、外瓶霉属等真菌相对丰度的变化可能与其根腐病的发生有密切关系,毛霉纲在健康卷丹百合根际土壤中富集可能与抗病性相关。

2.3 卷丹百合根腐病与健康植株根际土壤真菌群落差异分析

由图3可知,健康百合与空白土壤主要分布在第一主成分轴的负端,距离较近,患病百合主要分布在第一主成分轴的正端,表明健康健康植株根际与空白土壤真菌的物种组成趋于相似,而患根腐病百合与健康百合根际土壤真菌群落物种组成有一定的差异性。

2.4 卷丹百合根腐病与健康植株根际土壤真菌属水平LEfSe物种差异分析

如图4所示,患根腐病百合根际土壤真菌中子囊菌门、Cystobasidiiomycetes、散囊菌纲、Chaetothyriales、小丛壳目(Glomerellales)、锤舌菌科(Leotiaceae)、小疱毛壳科、暗色孢科(Dermateaceae)、小丛壳科(Glomerellaceae)、Tremellales_fam_Incertae_sedis、Gladophialophora、外瓶霉属、刺孢壳属(Chaetomella)、软盘菌属(Mollisia)、Colletotrichunm、Viridispora、Cuniculitrema相对丰度显著高于健康百合根际土壤,且子囊菌门丰度最高。大团囊菌科(Elaphomycetaceae)、粪盘菌科(Ascobolaceae)、粪壳菌科(Sordariaceae)、隔孢假壳科(Didymosphaeriaceae)、Ilyonectria、Thozetella、Rhexodenticula、Arcopilus、角菌根菌属(Ceratobasidium)、Mariannaea、大团囊菌属(Elaphomyces)、粪盘菌属(Ascobolus)、脉孢菌属(Neurospora)、Paraphaeosphaeria14类菌群在健康百合根际土壤中显著高于患根腐病百合土壤,Ilyonectria丰度最高。说明子囊菌门与Ilyonectria在患根腐病与健康百合根际土壤中差异最大。

图3 卷丹百合根腐病植株与健康植株根际土壤真菌物种丰度差异PCA分析Fig.3 PCA analysis of rhizosphere soil fungi between root rot plants and healthy plants of L.lancifolium

LDA阈值为2;图中节点大小对应于该分类单元的平均相对丰度;空心节点代表组间差异不显著的分类单元,而其它颜色的节点则表明这些分类单元体现出显著的组间差异。The current LDA threshold is 2.The size of nodes in the figure corresponds to the average relative abundance of the taxon; Hollow nodes represent taxa that do not differ significantly between groups, while nodes of other colors indicate that these taxa exhibit significant differences between groups.图4 卷丹百合根腐病植株与健康植株根际土壤真菌差异标志物种LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis of rhizosphere soil fungi between root rot plants and healthy plants of L.lancifolium

3 讨论

本研究利用Illumina Miseq平台对连作多年地块患根腐病和健康百合的根际土壤真菌群落结构差异进行分析,共获得876 022条有效序列,经过序列去噪和聚类后高质量序列比例超过94%。在未种植卷丹百合的空白土壤中,真菌Pielou’s evenness指数显著高于患病百合根际土壤,油壶菌门只在空白土壤中检测到,透孢黑团壳科、毛霉菌科、节菱孢属、毛霉属、Thozetella只在健康百合和患病百合根际土壤中检测到,子囊菌门在健康百合根际土壤中的相对丰度显著低于患病百合根际土壤;在空白土壤中,Ilyonectria的相对丰度显著低于健康百合根际土壤,子囊菌纲、刺盾炱目、小疱毛壳科的相对丰度显著低于健康百合和患病百合根际土壤,肉座菌科(Hypocreaceae)、篮状菌属、木霉属的相对丰度显著高于健康百合根际土壤;座囊菌纲、Trimorphomycetaceae、Saitozyma的相对丰度显著高于健康百合和患病百合根际土壤,说明种植百合改变了土壤真菌群落结构组成和丰度。

α多样性指数结果表明患根腐病百合与健康百合根际土壤真菌丰富度、均匀度和多样性无明显差异。PCA分析结果表明患根腐病百合与健康百合根际土壤真菌群落物种之间显著差异。Yuan等[20]通过大数据整合判断枯萎病准确发生的研究结果显示,子囊菌门在枯萎病发病土壤中的相对丰度更高,而被孢霉门(Mortierellomycota)在健康土壤中相对丰度更高,本研究中通过LEfSe方法进行标志物种分析,子囊菌门和Ilyonectria分别为患根腐病百合和健康百合根际土壤中相对丰度最高的标志物种,门水平统计结果也表明被孢霉门的相对丰度在健康百合土壤中更高,这一结果与Yuan等[20]的研究结果一致。

从门、纲、目、科、属5个不同分类水平对患病和健康百合根际土壤真菌群落物种组成及其相对丰度进行分析,在门水平,子囊菌门相对丰度最高,这与已有研究证实的忽地笑、丹参、猕猴桃以及干旱草原和灌丛等[11,21-23]多种植物根际真菌的优势菌门均为子囊菌门的研究结果一致。研究表明,散囊菌纲的部分真菌能引起红毛丹的茎溃疡病[24];咖啡锈病相关的真菌群落集中在虫草菌科和银耳目[25];小疱毛壳科中一些真菌具有植物致病性[26];棕球藻科(Phaeosphaeriaceae)、黑角藻属(Cladorrhinum)、镰刀菌属(Fusarium)、外瓶霉属和黑瘤藻科(Melanommataceae)在患根腐病黄连植物内生菌中显著富集[27];丛赤壳科是包含重要植物病原体的一个真菌类群,对葡萄、牛油果、橄榄等作物均具有致病能力[28];说明可能是卷丹百合根际土壤中富集散囊菌纲、银耳纲、刺盾炱目、银耳目、小疱毛壳科、丛赤壳科、外瓶霉属等真菌类群,从而导致植株易感根腐病。

LEfSe分析结果显示,大团囊菌科、粪盘菌科、粪壳菌科、隔孢假壳科、Ilyonectria、Thozetella、Rhexodenticula、Arcopilus、角菌根菌属、Mariannaea、大团囊菌属、粪盘菌属、脉孢菌属、Paraphaeosphaeria为健康百合根际土壤的标志物种。已有研究表明,Arcopilus的一些真菌类群能产生白藜芦醇,对人参、核桃黑斑病菌和杨树烟炭病菌、穿孔病菌、疡病菌等植物病原菌有较好的抑制效果[29-32];Ceratobasidiumspp.对水稻纹枯病菌和香蕉枯萎病病原菌均具有生防潜力[33-34],这可能是Arcopilus、角菌根菌属在健康卷丹百合根际富集的原因之一。西瓜枯萎病的发生与土壤中粪盘菌属等真菌属的相对丰度呈负相关[35];Paraphaeosphaeria部分真菌能产生取代苯并吡喃衍生物、异喹啉类生物碱等代谢产物对多种植物病原菌有抑制活性,与铁皮石斛共培养时能增强其抗病性,这可能与粪盘菌属、Paraphaeosphaeria为健康百合根际土壤的标志物种有重要关系[36-37]。由此可见,在连作多年百合地块,健康百合可能是由于根际土壤中富集Arcopilus、角菌根菌属、粪盘菌属、Paraphaeosphaeria等真菌,增强了其抗病性,其具体作用机制有待进一步研究。