氨基酸增值尿素对水稻生长和根系分泌物的影响

于雪娇, 胡冰洁, 袁 宏, 叶文玲, 张国漪

(安徽农业大学资源与环境学院,安徽 合肥 230001)

水稻是重要的粮食作物,全球一半以上人口以稻米为主食[1]。在水稻的种植过程中,尿素施用量较大,对环境造成了严重的影响。前人研究发现,以植物源(腐植酸、氨基酸、海藻提取物等)为增效载体,将尿素、复合肥等普通化学肥料进行改性增效而形成的增值肥料,在提高肥料利用率的同时,还能提升作物产量和品质[2]。

工业生产氨基酸纯品时会产生大量的发酵尾液[3],氨基酸发酵尾液中有蛋白质、菌体、氨基酸等营养物质,具有较高的回收利用价值。新型氨基酸增值尿素(Amino acid enhanced urea, AU)是在尿素熔融过程中加入氨基酸而创制的一种成本低、增效好的尿素产品。有研究结果表明,氨基酸肥料效果好、肥效快并且能够一定程度改善作物品质和生态环境[4]。因此,通过氨基酸与氮肥复配研制增效氮肥,是减肥增效、提升氮素利用率的重要技术途径。

土壤微生物是土壤中的生命成分,其数量高低在一定程度上反映了土壤的肥力水平高低[5]。根系分泌物是植物影响根际微生物环境的重要物质[6],通过影响微生物生长、繁殖及群落种类,进而影响作物生长[7]。

当前氨基酸肥料的应用主要有叶面喷施氨基酸肥料、化肥减氮配施氨基酸肥料等,对氨基酸肥料肥效的研究主要集中在研究植株生长以及作物的产量和品质等方面[8-9],而关于氨基酸增值尿素对根系分泌物中有机酸的影响,以及有机酸的改变与根际微生物相互作用对土壤养分影响的研究较少。本研究拟以水稻为试验对象,通过盆栽试验探究氨基酸增值尿素对水稻土壤理化性质、根际微生物和根系分泌有机酸的影响,以及各指标间的相关性,分析施用氨基酸增值尿素带来的影响,以期为氨基酸增值尿素在农业生产中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试作物为水稻两优8106。试验于安徽农业大学农萃园盆栽基地进行,供试土壤为安徽农业大学农萃园田间土壤耕层土,土壤有机质含量为8.27 g/kg,全氮含量为1.80 g/kg,碱解氮含量为161.50 mg/kg,有效磷含量为8.39 mg/kg,速效钾含量为180.93 mg/kg,pH值为6.81。氨基酸增值剂由中国农业科学院资源与农业区划研究所提供,其中氨基酸含量约为35%,成分以丝氨酸、谷氨酸、缬氨酸和甘氨酸为主。所有肥料作为基肥一次性施入土壤。

1.2 试验设计

试验共设4个处理:不施氮肥(CK)、施用氨基酸增值剂(AA)、施用尿素(U)、施用氨基酸增值尿素(AU)。试验用盆高18.0 cm,直径12.5 cm的黑色小桶,每桶装2 kg土壤,施肥情况见表1。每桶移栽10株水稻秧苗,分于5穴,每个处理重复5次。

水稻移栽后60 d进行整桶破坏性取样,10株水稻全部取出。收集2份根际土壤,一份于-80 ℃条件下冷冻保存在无菌离心管中,用于测序分析微生物群落,另一份晒干研磨后用于测定常规理化性质。

根系分泌物的收集:用蒸馏水和无菌水清洗水稻根部后,用无菌滤纸吸干水分放入离心管中,加入50.0 ml无菌水,用锡纸包裹离心管,将离心管放在培养室中连续收集根系分泌物6 h后,将收集到的根系分泌物过0.45 μm的滤膜,去除残根和杂质,装入50.0 ml离心管,冷冻干燥后将样品溶解于流动相中,再用0.22 μm的滤膜抽滤到1.5 ml进样小瓶,冷藏等待测定。将水稻根部冲洗后,测定植株地上部分鲜质量和根系鲜质量以及根系形态,以每株数值为计量单位。

1.3 测定方法

土壤全氮含量用凯氏定氮法进行测定,铵态氮含量用氯化钾浸提靛酚蓝比色法进行测定,硝态氮含量用酚二磺酸比色法进行测定[10]。用WinRHIZO根系扫描分析系统扫描测定根系形态。

有机酸含量采用超高效液相色谱(HPLC)VARIAN Prostar和紫外检测器测定。液相色谱测定条件为:Agilent588905-902 HC-C18色谱柱、柱温25 ℃、流动相为KH2PO4和乙腈(体积比为99∶1)、紫外波长210 nm、进样量20 μl。根据前期标准品的测定结果,用保留时间判断有机酸的种类、用峰面积计算有机酸的质量浓度。

土壤微生物DNA提取及测序委托北京百迈客生物科技有限公司完成。

1.4 数据处理和分析

采用Excel 2017、SPSS(24.0)进行数据分析,利用Canoco 5、origin 2022等软件绘图。

2 结果与分析

2.1 氨基酸增值尿素对水稻生长的影响

表2显示,与CK相比,施用氮肥处理的水稻株高、根长、地上部鲜质量和地下部鲜质量均增加。不同氮肥处理对水稻生长的影响存在差异,AA处理的地上部鲜质量显著低于U处理和AU处理;AU处理的水稻株高和根长均显著高于U处理和AA处理;AU处理的水稻地下部鲜质量显著高于AA处理。上述研究结果表明,氨基酸增值尿素对水稻生长具有一定促进作用。

表2 氨基酸增值尿素对水稻生长的影响

2.2 氨基酸增值尿素对水稻根系的影响

表3显示,不同氮肥处理对水稻根系生长的影响存在差异。AA处理的水稻根直径显著小于AU处理;U处理的水稻根投影面积最大。AU处理和U处理的水稻根表面积、根体积、根尖数均显著高于AA处理;AU处理的水稻根体积、根尖数显著高于U处理,分别增加25.28%和16.94%。说明氨基酸增值尿素对水稻根系生长发育具有促进作用。

表3 氨基酸增值尿素对水稻根系的影响

2.3 氨基酸增值尿素对水稻根际土壤养分的影响

表4显示,与CK相比,施用氮肥处理的水稻根际土壤pH值均下降,表现为U

表4 氨基酸增值尿素对水稻根际土壤养分含量的影响

2.4 氨基酸增值尿素对水稻根系分泌有机酸的影响

图1显示,CK中水稻根系分泌的有机酸主要为草酸、柠檬酸和酒石酸,占比分别为75.58%、18.25%和6.17%,有机酸总量为72.38 μg/g;AA处理中水稻根系分泌的有机酸主要为草酸、柠檬酸、乙酸和酒石酸,占比分别为26.47%、57.51%、14.01%和2.01%,有机酸总量为118.48 μg/g;U处理中水稻根系分泌的有机酸主要为草酸、酒石酸、乙酸和苹果酸,占比分别为5.83%、12.84%、71.22%和10.11%,有机酸总量为138.38 μg/g;AU处理中水稻根系分泌的有机酸主要为草酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸和丁二酸,占比分别为2.54%、37.29%、40.15%、17.81%和2.21%,有机酸总量为145.34 μg/g。

施肥可以提高根系分泌的有机酸总量,且AU处理的有机酸总量最高。CK和AA处理中草酸占比较高,U处理和AU处理中草酸占比较低,乙酸占比较高。与U处理相比,AU处理的草酸和乙酸占比减少,酒石酸占比增加,分泌的有机酸种类增加。

CK、AA、U、AU见表1。图中不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。图1 不同施肥处理对水稻根系分泌有机酸的影响Fig.1 Effects of different fertilization treatments on organic acid secretion of rice root

2.5 水稻根系分泌的有机酸和根际土壤环境因子的冗余分析

对有机酸和土壤环境因子进行冗余分析(RDA),结果(图2)表明,排序轴1(41.67%)和排序轴2(25.02%)累计解释有机酸组分变异的66.69%。铵态氮含量和pH值对有机酸组分影响最大,P值分别为0.002和0.006;草酸含量与土壤pH值呈正相关,但草酸含量和土壤全氮含量、铵态氮含量、硝态氮含量呈负相关;酒石酸含量、丁二酸含量与铵态氮含量、全氮含量、硝态氮含量呈正相关,与pH值呈负相关;乙酸含量、苹果酸含量与pH值亦呈负相关。

图2 水稻根系分泌的有机酸组分和土壤环境因子的冗余分析Fig.2 Redundancy analysis of organic acid components secreted by rice roots and soil environmental factors

2.6 氨基酸增值尿素对水稻根际土壤菌群多样性的影响

对不同处理下的水稻根际土壤菌群多样性进行研究,使用QIIME软件对物种多样性进行分析,包括Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数。结果(表5)表明,土壤菌群的操作分类单元(Operational taxonomic unit,OTU)数量为1 432～1 524,AU处理和U处理的OTU数量显著高于AA处理。AU处理的Chao1指数显著高于U处理和AA处理,表明AU处理的群落组成比U处理和AA处理丰富,AU处理的群落多样性有一定提高。

表5 土壤菌群的α多样性分析

2.7 氨基酸增值尿素对水稻根际土壤菌群组成的影响

通过高通量Illumina Miseq技术对水稻根际土壤样品的测序结果进行分析,图3A显示,在门水平上,水稻根际土壤样品中相对丰度大于1%的前10个优势菌群有Nitrospirae、Gemmatimonadetes、Latescibacteria、Verrucomicrobia、Firmicutes、Chloroflexi、Actinobacteria、Acidobacteria、Bacteroidetes、Proteobacteria,其中相对丰度最高的是Proteobacteria、Bacteroidetes、Acidobacteria。在门水平上,各处理优势菌群种类无明显变化,但菌群的相对丰度存在差异。另外,不同施肥处理没有改变水稻根际土壤中的前3个优势菌群。与U、AA处理相比,AU处理下Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes的相对丰度增加,Acidobacteria的相对丰度下降。

图3B显示,在属水平上,水稻根际土壤样品中相对丰度较高的前10个优势菌群为MND1、Lysobacter、Ramlibacter、RB41、Ellin6067、uncultural_bacteria_f_Chitinophagaceae、Sphingomonas、Aeromonas、Flavobacterium、uncultural_bacterium_c_Subgroup_6。施肥处理中,相对丰度最高的前两个优势菌群为Aeromonas和Flavobacterium。不同施肥处理间优势菌群种类无明显变化,但相对丰度存在差异。与CK相比,施肥处理下Aeromonas的相对丰度明显增加,uncultural_bacterium_c_Subgroup_6和Sphingomonas的相对丰度明显下降。与U、AA处理相比,AU处理的Aeromonas的相对丰度增加。与U处理相比,AU处理的Sphingomonas和Flavobacterium的相对丰度增加。

CK、AA、U、AU见表1。图3 不同施肥处理下水稻根际土壤中细菌门和属分类水平群落组成Fig.3 The community composition of soil bacteria at phylum and genus levels under different fertilization treatments

2.8 水稻根系分泌的有机酸与根际土壤微生物群落组成的相关性

对根系分泌的有机酸与根际土壤门水平前10种优势菌群的相关性进行分析,结果(图4)表明,除了Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria外,草酸含量与其他菌群相对丰度均有较高的相关性。Bacteroidetes相对丰度与丁二酸含量呈正相关,Firmicutes相对丰度与酒石酸含量呈正相关。

NIT:Nitrospirae相对丰度;GEM:Gemmatimonadetes相对丰度;LAT:Latescibacteria相对丰度;VER:Verrucomicrobia相对丰度;FIR:Firmicutes相对丰度;CHL:Chloroflexi相对丰度;ACT:Actinobacteria相对丰度;ACI:Acidobacteria相对丰度;BAC:Bacteroidetes相对丰度;PRO:Proteobacteria相对丰度。图4 水稻根系分泌的有机酸与根际土壤微生物群落的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of organic acids secreted by rice roots and microbial communities in rhizosphere soil

2.9 水稻根系分泌的有机酸、根际土壤环境因子、根际土壤微生物群落三者间的相关性

图5显示,pH值与草酸含量、多数菌群相对丰度呈正相关,表明多种优势菌群受土壤酸碱度影响;丁二酸含量、酒石酸含量与全氮含量、铵态氮含量、硝态氮含量以及Bacteroidetes相对丰度、Firmicutes相对丰度、Proteobacteria相对丰度之间呈正相关关系。

NIT:Nitrospirae相对丰度;GEM:Gemmatimonadetes相对丰度;LAT:Latescibacteria相对丰度;VER:Verrucomicrobia相对丰度;FIR:Firmicutes相对丰度;CHL:Chloroflexi相对丰度;ACT:Actinobacteria相对丰度;ACI:Acidobacteria相对丰度;BAC:Bacteroidetes相对丰度;PRO:Proteobacteria相对丰度。图5 水稻根系分泌的有机酸与根际土壤环境因子及根际土壤微生物群落的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of organic acids secreted by rice roots, rhizosphere soil environmental factors and rhizosphere soil microbial communities

3 讨 论

3.1 氨基酸增值尿素对水稻生长和根际土壤养分的影响

本研究结果表明,氨基酸增值尿素可以促进作物生长,这一结果与前人的研究结果[11]一致。与单施尿素相比,施用氨基酸增值尿素可以显著提高水稻的株高、根长、根体积、根尖数。施用氨基酸增值尿素对作物生长具有一定的促进作用,可能是因为氨基酸能够提高土壤中部分酶的活性,从而促进植物生长[12]。有研究结果表明,施用氨基酸增值尿素可减少稻田氨挥发损失,使氮素在土壤中缓慢释放,保存较长时间,供作物吸收利用[13]。朱荣等[14]认为增效复合肥能够抑制土壤脲酶活性,具备一定的缓释效应,增强土壤对氮素的吸附,从而促进作物根系生长。

在本研究中,施用氨基酸增值尿素处理的水稻根际土壤硝态氮含量、铵态氮含量和全氮含量与单施尿素处理差异不显著。巨晓棠等[15]研究发现,氨基酸和尿素熔融复合后,有利于土壤对铵态氮和全氮的保蓄,使尿素态氮含量在土壤中保持稳定。

3.2 氨基酸增值尿素对水稻根际土壤微生物的影响

本研究结果表明,不同施肥处理对于水稻根际土壤微生物群落结构具有一定的影响,氨基酸增值尿素处理下微生物群落的丰富度和物种多样性均高于尿素处理。通过对根际土壤微生物进行分析发现,施用氨基酸增值尿素明显影响水稻根际菌群结构,这与前人研究结果[16]一致。在门、属2个水平上,比较不同施肥处理下水稻根际土壤菌群组成,发现部分优势菌群的相对丰度发生明显变化。在门水平上,前人研究发现,Proteobacteria和Acidobacteria是水稻根际土壤中的优势菌群[17]。其中,Proteobacteria属于富营养型细菌,Acidobacteria属于寡营养型细菌[18]。土壤养分是影响菌群分布的主要因素之一,当土壤养分升高时,富营养型细菌丰度会随之升高,而寡营养型细菌丰度会随之下降[19]。植物根际土壤中Bacteroidetes的相对丰度越高,植物对逆境的抗性越强[20]。在本研究中,Acidobacteria、Bacteroidetes和Proteobacteria在各处理中都占有较高的相对丰度,与单施尿素处理相比,施用氨基酸增值尿素处理的Bacteroidetes、Proteobacteria相对丰度明显增加,Acidobacteria相对丰度明显下降,表明施用氨基酸增值尿素可以使土壤养分含量提高,并且能够增强水稻的抗逆性。

在属水平上进行分析,发现与单施尿素处理相比,施用氨基酸增值尿素处理的Sphingomonas、Flavobacterium相对丰度增加。Sphingomonas是一种潜在的有益细菌属,可以缓解疾病症状、抑制病原体生长,也可以促进植株的生长和N、Ca、Zn、S等养分的吸收[21]。Flavobacterium可以溶解土壤中的磷,从而增加植物对磷素的吸收[22]。Sphingomonas、Flavobacterium均对作物有益。因此,Sphingomonas和Flavobacterium相对丰度的增加,对植物生长起到一定的促进作用。

3.3 水稻根系分泌的有机酸对根际土壤养分及根际土壤微生物的影响

根系分泌物作为重要的媒介,在根系-土壤-微生物之间具有传递营养的重要功能[23]。根系的增加会对分泌物产生影响,特别是分泌物中的有机酸。在本研究中,与不施氮肥对照相比,施肥处理提高了有机酸分泌的总量,其中氨基酸增值尿素处理下有机酸分泌总量最高,说明氨基酸增值剂的加入提高了水稻根系分泌有机酸的含量。在本研究中,不同施肥处理的有机酸组成有所改变,与单施尿素处理相比,氨基酸增值尿素处理的酒石酸、丁二酸和柠檬酸的占比增加。前人研究结果表明,酒石酸的分泌有利于提高氮素利用率,从而使水稻产量增加[24]。丁二酸分泌量的增加,能够增加水稻籽粒中镁、钾等元素含量,降低锌、铅等元素毒性[25]。柠檬酸的分泌有利于促进土壤镉转化为可利用形式,提高了作物对镉的吸收和富集[26]。

对水稻根系分泌的有机酸和根际土壤环境因子进行冗余分析发现,二者存在一定相关性。有研究结果表明,根系分泌的有机酸能够改善土壤结构,促进土壤中养分溶解,从而提高作物对养分的吸收,最终促进作物生长[27]。在本研究中,全氮含量、铵态氮含量、硝态氮含量与酒石酸含量、丁二酸含量呈正相关,硝态氮含量、pH值与柠檬酸含量呈正相关。酒石酸含量增加与氮供应量增加具有一致性[28],说明酒石酸含量与全氮含量、铵态氮含量、硝态氮含量均呈正相关。丁二酸是影响微生物氮循环和硝化作用的重要因素[29],因此,丁二酸含量与氮含量具有相关性。

对水稻根系分泌的有机酸组分与根际土壤微生物群落进行冗余分析发现,水稻根际微生物群落与根系分泌的有机酸具有相关性。前人研究结果表明,根系分泌物改变会影响根际微生物群落组成和比例[30]。本研究发现,草酸含量与多数菌群相对丰度呈正相关;Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria的相对丰度与丁二酸含量、酒石酸含量呈正相关,与前人研究结果[31]一致。有益细菌增多能够提升养分的可用性,刺激植物生长发育[32]。因此,Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria等有益细菌相对丰度的增加有利于根系分泌更多的有机酸,当有机酸含量增多时,有利于根际养分的释放,从而促进作物的生长。

根系分泌的有机酸组分、根际土壤微生物群落及根际土壤环境因子三者间的冗余分析结果表明,土壤pH值与草酸含量、多数菌群的相对丰度存在正相关关系;酒石酸含量、丁二酸含量与全氮含量、铵态氮含量以及Proteobacteria、Bacteroidetes的相对丰度呈正相关。有研究结果表明,根系分泌的有机酸与土壤养分之间存在密切关系,因此根系分泌的有机酸能够对水稻生长起到一定促进作用[33],同时有机酸也是许多微生物的营养来源[34],且根系分泌的有机酸有助于根际养分的释放,影响土壤微生物组成[35]。土壤中草酸含量会影响pH值和菌群的重组[36],从而影响微生物群落的丰富度和多样性[37]。酒石酸和丁二酸在提高土壤养分利用率和作物生产力方面发挥着重要作用[38]。

4 结 论

与单施尿素相比,施用氨基酸增值尿素可以促进水稻幼苗生长、水稻根系生长以及根系形态建成。与不施氮肥对照相比,施用氨基酸增值尿素降低了根际土壤pH值,土壤生态环境得到改善,对微生物的生长有益。与单施尿素处理相比,施用氨基酸增值尿素处理提高了微生物群落的丰富度,改变了土壤中部分优势菌群的相对丰度,影响了根系分泌有机酸的种类以及含量。因此,氨基酸增值尿素是一种良好的、可以替代部分尿素的氮素肥料。