铁死亡发生机制及其在三阴性乳腺癌治疗中的研究进展

裴秀君 姚航宇 王继荣 马波*

近些年，越来越多的研究在乳腺领域取得了突破性进展，但乳腺癌（breast cancer，BC）全球发病率仍在上升，已成为导致女性疾病负担的主要癌症。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是目前乳腺癌分子分型中最具侵袭力的类型，其异质性高、预后差，在我国乳腺癌综合治疗及预后因素分析中尚具挑战。因此，为三阴性乳腺癌患者开发出更新型的治疗药物，提供更精准的干预措施尤为迫切。铁死亡（ferroptosis）是2012 年提出的细胞新型死亡方式，随着这一概念的提出，人们发现铁死亡在肿瘤发生、发展及多重耐药方面发挥着重要作用。近些年越来越多靶向铁死亡的活性药物被开发应用。通过药物影响使细胞以这种独特高效的方式死亡，已成为一种颇有前景的癌症药物研究策略。本文将对铁死亡发生机制及其在三阴性乳腺癌治疗中的作用进行综述。

1 铁死亡概述

1.1 铁死亡的发现 2003 年DOLMA 等［1］发现了一种新型化合物Erastin，由这种化合物所诱导的细胞死亡都是非凋亡性的。随后YANG 等［2］发现了另一种可有效引起细胞发生此种死亡形式的化合物（Ras-selective-lethal compound 3，RSL3）。之后越来越多的研究发现细胞以这种未知的方式死亡，这些现象象征着一种新型细胞死亡形式的出现，且该过程拥有独特的形态学变化，但尚不清楚其机制。直至2012 年DIXON等［3］根据其生物学特点将其正式命名为铁死亡：一种铁依赖性的，以细胞内活性氧堆积为特征的细胞死亡。

1.2 铁死亡的特征 铁死亡区别于传统细胞死亡，颇有自己的独到之处。其形态学特征表现为：线粒体体积变小、膜密度增加、嵴显著减少甚至消失，而细胞核大小又接近正常，无核浓缩或鲜有核染色质边缘化，这正是铁死亡区别于凋亡、坏死、自噬等过程的主要形态学特征［3］；其生化特征主要表现为：细胞内铁和脂质活性氧（lipid reactive oxygen species，Lip-ROS）积累，胱氨酸谷氨酸反向转运体（system Xc-）抑制以及NADPH 氧化增加等；其次，该过程不能在短期内被细胞传统死亡过程的抑制剂所抑制，却可以通过铁螯合剂、抗氧化剂等加以逆转［1］。

2 三阴性乳腺癌细胞铁死亡机制

铁死亡过程的发生规律及其演变过程相当复杂，目前认为不同信号通路最终都会通过直接或间接影响谷胱甘肽过氧化物酶的抗氧化活性，降低细胞整体抗氧化能力，致使脂质过氧化反应增加，Lip-ROS 堆积，最终引起细胞铁死亡。

2.1 通过选择性抑制System Xc- 诱导TNBC 细胞铁死亡 1980 年System Xc-在人类胎儿成纤维细胞中被发现［4］，其是由跨膜转运蛋白SLC7A11 和调节蛋白SLC3A2L 经磷酸二硫键连接而成的异二聚体，介导胱氨酸进入细胞并将谷氨排出。肿瘤细胞胞外半胱氨酸含量不足时，可由转硫途径提供半胱氨酸（Cys），调节细胞铁死亡［5］。抑制System Xc-对胞外胱氨酸的转运，胞内Cys 含量迅速减少，致使谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成进一步受阻，而GSH 又是谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPXs）发挥作用的必要辅助因子，因此导致肿瘤细胞GPXs 活性进一步降低，细胞抗过氧化能力相应下降，细胞ROS 过度积累，从而诱发肿瘤细胞铁死亡。经典高效的铁死亡诱导剂Erastin 通过选择性抑制System Xc-活性诱导铁死亡［3］。有研究表明System Xc-的两个亚基表达水平决定了GPX4 在BC 中的表达，因此根据System Xc-状态靶向BC 细胞铁死亡为抗BC 治疗带来了新希望［6］。在低雌激素受体表达的BC 中，YU 等［7］发现柳氮磺胺吡啶可作为System Xc-抑制剂，引起BC 细胞铁死亡。HASEGAWA等［8］认为，下调MUCI-C/System Xc-信号通路同样可以抑制TNBC 细胞活性甚至杀灭TNBC 细胞，从而使致瘤性细胞生长及转移得到控制。因此，选择性抑制TNBC 细System Xc-从而诱导铁死亡发生或许是攻克TNBC 的新方向。

2.2 直接作用于TNBC 细胞GPX4 GPXs 家族包括GPX1-GPX8，DOLL 等［9］认为，GPX4 在铁死亡中扮演着重要角色。GPX4 在GSH 辅助下，将游离H2O2和Lip-ROS 分别降解为H2O 和相应的醇，从而有效降低胞内脂质氢过氧化物及有机氢过氧化物水平，避免由Fenton 反应产生过量活性氧所致的铁死亡［10］。与Erastin 作用机制不同，RSL3 能够选择性作用于靶细胞的GPX4 受体部位［11］，诱发细胞铁死亡。TNBC是一类富有铁及脂质的肿瘤，诱导铁死亡的发生对TNBC 治疗极其重要。有研究表明PTL 的衍生物DMOCPTL，可通过泛素化GPX4 显著抑制TNBC 细胞的增殖从而诱导细胞铁死亡和凋亡［12］。YANG 等［13］通过多组学测序发现TNBC 亚型LAR 肿瘤与铁死亡存在明显相关性，其主要铁死亡抑制途径与GSH 有关，且该过程由GPX4 所介导。除此之外，有研究表明在无家族史的BC 患者中ACSL4/GPX4 联合水平可作为接受新辅助化疗患者病理完全缓解的新型预测和预后生物标志物［14］。因此，直接靶向GPX4 同样可以高效诱发TNBC 细胞铁死亡。

2.3 促进TNBC 细胞Lip-ROS 堆积 在正常细胞生理周期中，脂质氧化与还原处于动态平衡状态。但随着肿瘤细胞癌变，这种平衡状态将会被打破。过量的活性氧自由基会对细胞成分产生不利修饰，如脂质、蛋白质和DNA 损伤［15-16］等。ROS 可产生大量损伤细胞脂质膜层结构的多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）从而形成大量Lip-ROS，当胞内存在大量Lip-ROS 时就会引起铁死亡，这就是“脂质过氧化”。MA 等［17］报道，西拉明和拉帕替尼可使ROS 增多诱导细胞铁死亡，同时CDO1 过表达时BC 细胞GSH 水平降低，导致ROS 进一步积累，从而加剧BC 细胞铁死亡。此外，有研究发现与肿瘤周围脂肪细胞共培养的TNBC 细胞表现出对铁死亡抵抗现象，且该过程依赖脂肪细胞分泌的脂肪酸合成酶ACSL3［18］。虽然Lip-ROS 的过量积累在铁死亡研究中发挥着重要的作用，但过多的Lip-ROS 到底来源于线粒体膜、内质网膜、还是其他细胞组织的膜性结构目前尚不明确。高通量测序分析发现小分子抗氧化剂如Ferropstatin-1 可以直接降低体内Lip-ROS 的堆积，从而成功阻断由Erastin 及RSL3等化学物质诱导而发生的铁死亡［3］。此外，PUFAs 还可以通过酶促或非酶促的氧化反应，形成脂质氢过氧化物。此时细胞的胞质分子结构中如果存在着大量的铁离子，脂质氢过氧化物就会进一步产生有毒性的脂质自由基，从而造成细胞损伤。且这些自由基能转移邻近PUFAs 的质子，启动细胞新一轮的脂质氧化反应最终造成一个更严重的细胞氧化性损伤。因此通过各种途径加剧TNBC 细胞Lip-ROS 堆积，是TNBC综合治疗的一部分。

2.4 增加TNBC 细胞铁含量 维持机体铁离子平衡是正常生理功能所必需的。血液中游离的Fe3+与转铁蛋白（transferrin，TF）结合，通过转铁蛋白受体（transferrin receptor，TFRC）形成内涵体进入胞内。随后Fe3+在铁还原酶前列腺六次跨膜蛋白3（STEAP3）的作用下被还原为Fe2+，从内涵体转运到胞质溶胶中，然后通过细胞膜上的膜铁转运蛋白（ferroportin）泵出，或储存于胞质内的铁蛋白（ferritin）中。当胞内Fe2+过多时这种平衡将被打破，进一步通过Fenton 反应产生高活性羟自由基，直接与细胞膜结构中的PUFA 进行反应，产生大量的Lip-ROS，从而进一步引发铁死亡。有研究表明，在TNBC 细胞系MDA-MB-231 细胞中高饱和度乳铁蛋白可以通过增加细胞铁含量，促进ROS 的生成，导致了细胞铁死亡等现象的发生。然而低饱和度乳铁蛋白又可以通过上调SLC7a11的表达，增加GSH 的生成，从而抑制细胞铁死亡现象的发生［19］。除此之外，Yu 等证实了抗HER2 治疗后的关键基因成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）可通过β-catenin/TCF4-SLC7A11/FPN1 轴加速胱氨酸摄取和Fe2+外排。抑制FGFR4可导致不稳定铁池积累，从而触发细胞铁死亡［20］。因此，增加细胞铁含量，诱发铁死亡发生或许可以有效阻止BC 患者的恶性进展。

2.5 p53 介导的TNBC 细胞铁死亡 已有研究表明，多种肿瘤抑制因子可以促进细胞对铁死亡的敏感性。因此，肿瘤抑制可能是铁死亡先天性生理功能［21］。研究发现p53 除了诱导细胞凋亡，还可以诱导细胞铁死亡。JIANG 等［22］认为，p53可选择性抑制System Xc-亚基SLC7A11 的异常表达，显著抑制GPX4 活性，从而引起细胞铁死亡。然而近期研究发现，p53 热点突变蛋白p53R175H 可与转录因子BACH1 特异性结合。该过程既可以解除BACH1 对SLC7A11 的下调作用，抑制铁死亡，促进肿瘤生长；又可以上调促转移靶点的表达，促进肿瘤转移［23］。因此，针对不同类型的p53 突变，个性化的治疗方案尤为重要。在目前BC 铁死亡研究中，p53 主要发挥促进铁死亡作用，但实际上该过程是否也存在双重调控作用呢？更深入的研究或许可以为BC 患者提供更精准的个性化治疗方案。

3 铁死亡在三阴性乳腺癌治疗中的作用

3.1 在放化疗中增强抗癌作用 TNBC 患者目前仍不能从传统靶向治疗中明显获益，化疗仍是其积极选择。但肿瘤细胞大量的凋亡逃逸使得多数肿瘤细胞逐渐对化疗药物产生耐药性。如何克服此类化疗耐药现象，使药物发挥最大治疗作用将成为新型抗肿瘤药物亟待解决的问题。使肿瘤细胞以铁死亡的形式抑制其增殖，是否同样可以增强抗癌作用呢？CHEN等［24］将经典的铁死亡诱导剂Erastin 与他莫昔芬联合应用，发现Erastin 可以与他莫昔芬协同对抗癌细胞。因此，铁死亡诱导剂与化疗药物的联合应用，或许是解决BC 细胞化疗耐药的一种方法。在放疗增敏中铁死亡过程同样发挥重要作用，其中乳铁蛋白（lactoferrin，Lf）是一种多效性蛋白质，铁饱和型乳铁蛋白（holo-lactoferrin，Holo-Lf）则是Lf 的饱和结构形式，ZHANG 等［19］在多项研究中发现，Holo-Lf 在TNBC 的联合治疗中发挥重要作用，可以有效增强TNBC 细胞内的总铁含量，促进肿瘤细胞ROS 和脂质代谢中的过氧化终产物丙二醛酶（MDA）的生成，致使肿瘤细胞铁死亡。此外用Holo-Lf 联合放疗剂量4Gy 处理MDA-MB-231 细胞，可使Lip-ROS生成水平显著升高，表明Holo-L 联合放疗确实能通过促进铁死亡，增强肿瘤细胞对放疗的敏感性。

3.2 在免疫治疗中增强抗癌作用 2019 年邵志敏教授团队将TNBC 分为4 个不同分型，包括间质样亚型、管腔雄激素受体亚型、免疫调节亚型、基底样免疫抑制亚型。这使TNBC的分型变得更加科学与精细，治疗方式变得更加全面而精准。在此基础上，此团队在TNBC 不同亚型铁死亡领域的研究中取得了突破性进展。研究发现管腔雄激素受体亚型，以雄激素受体活性上调和管腔样基因表达异常为共同特征，可通过有效激活氧化磷脂酰乙醇胺和调节谷胱甘肽代谢酶活性（特别是GPX4）来激活或诱导BC 细胞铁死亡，同时也可以通过GPX4 抑制直接诱导铁死亡。此期研究最富有临床意义的发现是抑制GPX4 可以通过与抗PD1 免疫治疗联合应用进一步增强抗肿瘤免疫治疗效果，这将为难治性TNBC 开展临床药物治疗探索出新的研究策略［13］。免疫治疗近些年在癌症治疗中发挥了一定作用，如何促进癌症免疫治疗的应用是目前需要攻克的难点。有学者提出一种较为独特的PDTAC 策略，该策略由三个可替换模块组成，以协助诱导蛋白质的光降解。基于PDTAC 策略的GPX4 靶向降解为诱导铁死亡提供一种新的方法［25］。

3.3 在中药材中增强抗癌作用 随着中华传统医学的传承与发展，中药材在临床治疗中发挥的作用越来越大。枸杞多糖是我国传统中药材，有研究表明，其提取物中包含一种抗肿瘤多糖成分，可选择性通过蛋白溶质载体家族7 成员11（SLC7A11）和谷胱甘肽的过氧化酶4（x CT/GPX4）途径间接介导TNBC细胞铁死亡［26］。这将转化为TNBC患者的现代中药靶向治疗，为抗癌研究提供了新思路。舒肝宁注射液（SGNI）是临床治疗肝脏疾病的中成药，由于肝脏保护和免疫改善，也被广泛用于癌症辅助治疗。有研究表明与非TNBC 细胞和正常细胞相比，SGNI 能以HO-1 依赖的方式诱导TNBC 细胞氧化应激并促进细胞内不稳定铁池积累，从而导致TNBC 细胞铁死亡［27］。此外，重楼皂苷［28］、人参皂苷CK［29］、隐丹参酮［30］等均被证实可直接诱导或通过干扰不同信号通路间的传导对TNBC 细胞铁死亡产生一定影响，抑制并阻碍肿瘤细胞增殖。

3.4 在新型药物传递系统中增强抗癌作用 近些年，外泌体成为国内外研究热点，研究表明外泌体在阻止肿瘤细胞恶性进展方面发挥重要作用。与此同时Erastin 作为铁死亡诱导剂，存在水溶性差、生物利用率低等缺点。因此，需要一种有效的药物递送方法来克服Erastin 的障碍。YU 等［31］使用载有Erastin 的外泌体（Erastin@FA-exo），将Erastin 高效传送至MDA-MB-231 细胞相应靶点，从而精准高效诱导MDAMB-231 细胞发生铁死亡。RSL3 同样存在水溶性低、生物相容性差等缺点，使得GPX4 抑制剂在体内应用受限。为使TNBC 细胞克服传统化疗抗性，有学者开发了一种主动靶向的小分子自组装纳米药物。该药物可同时传递化疗药物喜树碱（CPT）、铁催化剂（Fc）和GPX4 抑制剂（RSL3），形成三组分的纳米药物RSL3@CPT-SS-Fc，在肿瘤环境中较多的GSH 可以分解纳米药物，使细胞同时发生铁死亡与凋亡［32］。因此，联合新型药物传递系统更精准地将药物传送至相应靶点协助增强抗癌效果，将成为肿瘤领域新型治疗策略。

4 小结

近些年铁死亡被定义为细胞新型死亡方式，成为医学研究与生物学研究热点。TNBC 缺乏特异性靶点，对化疗药物存在一定耐药性，成为乳腺癌领域的难治性类型。随着药物应用研究的不断发展，铁死亡在传统中药材中可以增强抗癌敏感性；使用新型药物递送方法可以更加安全精准地传送药物至最理想作用位点。这些研究与发现都为肿瘤领域临床治疗及药物应用带来了新希望。