肿瘤微环境在食管癌中的研究进展

张家豪,何珂瑶,李超伟,张哲源,代宁涛,杨海军,李军扩,刘怡文,孙 蔚,郭艺博,孔金玉,周福有,4

食管癌(esophageal cancer,EC)是常见高发病率且预后较差的消化道肿瘤,病理学分为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)、食管腺癌、神经内分泌癌等多种类型,其中ESCC约占我国EC的90%以上[1]。EC的发生发展是多因素共同作用的过程,涉及肿瘤细胞自身特质及肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)调控影响。TME由基质细胞、免疫细胞、细胞外基质及信号分子等成分组成,在介导肿瘤细胞增殖转移及免疫逃逸中发挥重要作用。TME可通过调控细胞因子的分泌和信号通路的传导,为促进EC的发生发展提供必要条件;TME重塑可增强肿瘤细胞恶性生物学能力并影响抗肿瘤治疗效果,这可能也是EC患者常规治疗耐药的重要原因[2]。因此,深入了解TME的组成,以及靶向TME治疗EC的相关策略,有望为EC精准治疗提供新靶标。

1 TME的组成

1.1 肿瘤相关成纤维细胞

肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)是TME中最丰富的间质细胞,由成纤维细胞、上皮细胞和平滑肌细胞等多种细胞转化而来,在肿瘤的发生发展过程中发挥着关键作用。肿瘤细胞分泌转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)诱导CAFs活化,使其产生多种细胞因子,促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移[3]。α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)是肌成纤维细胞的激活标志物,特征性表达α-SMA的CAFs具有更高的细胞增殖活性和迁移能力。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)产生细胞内活性氧,介导成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化。据报道,抑制NOX4的活性并下调α-SMA的表达,可阻碍CAFs生成,在体内外模型中达到抗肿瘤作用[4]。研究发现,CAFs生成与EC患者更差的肿瘤分期和更高的淋巴结转移率呈正相关,且CAFs+α-SMA阳性患者预后更差[5],提示具有肌成纤维细胞表型的CAFs可能作为评估EC患者预后的指标。此外,CAFs可促使肿瘤细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),诱导EC的血管形成;CAFs还可介导Wnt相关蛋白高表达并激活其信号通路,调控EC的恶性增殖[6]。体外研究发现,EC细胞系与CAFs共培养后肿瘤细胞增殖能力增强,而清除CAFs后癌细胞凋亡增加[7]。以上研究表明CAFs参与EC的进展,阻断CAFs形成可能是EC患者的新型治疗策略。

1.2 肿瘤相关免疫细胞

TME中存在大量免疫细胞,其中肿瘤相关免疫细胞主要有肿瘤相关巨噬细胞(tumor-as-sociated macrophage,TAM)、调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)和髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)。TAM是最典型的肿瘤浸润性免疫细胞,参与肿瘤发生发展的每个阶段。TME诱导TAM分化为经典活化的M1型和替代活化的M2型。M1型分泌各种炎性细胞因子促进机体炎症反应,M2型分泌促血管生成因子诱导肿瘤血管生成,并激活免疫抑制途径促进肿瘤进展。在大多数实体肿瘤中TAM的丰度与患者预后呈负相关。一项关于TAM与ESCC的Meta分析发现,M2型TAM浸润患者对新辅助治疗反应性差,TNM分期增加且总体生存率降低[8]。单一手术治疗的食管腺癌患者中,M2型TAM高度浸润患者预后差[9]。由此可见,TAM的浸润程度与EC进程和总生存期(overall survival,OS)缩短密切相关。此外,TAM可通过分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和多种促血管生成因子促进EC增殖、转移及脉管生成[10],因此靶向TAM可能是有潜力的EC治疗突破口。

Treg构成大多数肿瘤免疫浸润细胞的重要部分,肿瘤或基质细胞释放趋化因子在EC中募集Treg,抑制自身反应性T细胞增殖和细胞因子生成,介导肿瘤细胞发生免疫逃逸[11]。叉头蛋白分子3(forkhead box p3,Foxp3)是Treg特异性标志因子,其表达调控Treg的发育和功能。研究发现,EC组织中Foxp3+Treg富集患者较CD8+Treg富集患者预后差,并且Foxp3+Treg富集是影响患者预后的独立危险因素[12]。Treg细胞可分泌白细胞介素(interleukin,IL)-10和TGF-β,抑制T细胞免疫应答;IL-32则通过促进Foxp3+Treg细胞发育,削弱抗EC治疗效应[13]。EC患者中CD4+CD25+Treg表达显著高于健康对照组,并与淋巴结转移及TNM分期密切相关[14]。以上研究支持Treg广泛参与EC的发生发展。因此,充分认识Treg及其亚群与EC的关系,靶向Treg可能使患者重新获得有效的T细胞介导抗瘤活性。

MDSC来源于骨髓,是具有免疫抑制功能的异质性细胞群。MDSC在TME中调控免疫应答,可阻碍细胞周期完成,抑制免疫杀伤细胞活性并促进肿瘤增殖。ESCC患者中MDSC水平增加伴有程序性死亡蛋白受体配体1(programmed death ligand 1,PD-L1)高表达,同时,MDSC衍生的TGF-β可诱导CD8+T细胞高表达程序性死亡蛋白受体1(programmed death,PD-1)[15]。可见,MDSC通过PD-1/PD-L1途径对T细胞发挥免疫抑制作用,并与肿瘤负荷、淋巴结转移和肿瘤分期相关。MDSC还可抑制IL-2和IL-10生成,介导T细胞失活,缩短EC患者OS[15],提示全面考虑MDSC在EC进展中的作用将有效提高患者预后评估价值。醛脱氢酶1相关信号通路和IL-6可诱导MDSC活化,招募MDSC在EC中浸润,削弱机体抗肿瘤免疫反应[16]。MDSC核转录因子NF-κB信号通路的激活可上调IL-4RA的表达和一氧化氮的生成,抑制CD8+T细胞的细胞毒性,从而促进肿瘤细胞生长[17]。因此,MDSC在EC逃避免疫监视中发挥重要作用,干预MDSC可能是EC免疫治疗的新途径。

1.3 细胞外基质

TME的组成除细胞成分外,非细胞成分主要有细胞外基质及各种细胞因子和蛋白酶等。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肿瘤发展过程中呈动态变化,以促进瘤细胞增殖转移。ECM的重要成分I型胶原和糖蛋白共同参与细胞间黏附,影响治疗药物的渗透和运输,其改变已被证明与肿瘤细胞侵袭性增强相关。整合素作为细胞黏附分子家族的重要成员之一,介导肿瘤细胞与ECM的信号通路传导,并调控肿瘤细胞的增殖、分化。体外研究发现,通过敲除整合素α6可抑制EC细胞的增殖、侵袭[18],证明整合素α6可能是EC潜在的治疗靶点。此外,ECM重塑依赖于基质可降解的蛋白水解酶,包括MMPs、纤溶酶原激活剂和糖酵解酶。研究已鉴定出30多种MMPs,其中MMP-2和MMP-9过表达与EC患者TNM分期、肿瘤浸润深度和淋巴结转移相关。MMPs还受其内源性天然抑制物(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMPs)所调节,TIMPs低表达且MMPs高表达的EC患者预后更差[19]。外源性MMPs抑制剂目前已有效治疗牙周病、多发性硬化症和胃癌,未来将有望运用于EC。赖氨酰氧化酶是ECM的重要酶,研究发现沉默赖氨酰氧化酶可抑制ESCC细胞的增殖,降低其侵袭和迁移能力[20]。ECM作为TME的组成成分之一,对EC的进展及预后评估有着重要影响。探明ECM在EC中的作用机制,有望为抗EC治疗提供新方向。

2 靶向TME治疗EC的相关策略

2.1 抗血管生成

肿瘤血管通过输送氧气和营养物质,促进肿瘤细胞扩散和转移。肿瘤血管生成受多种血管生长因子调节,其中VEGF是血管生成的高特异性调控因子,结合其受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)触发ERK1/2和PI3K/Akt下游信号通路传导,促进肿瘤细胞增殖及分化,表明调控VEGF/VEGFR通路是抗血管生成药物治疗EC的有效机制。目前已研发多种VEGF/VEGFR抑制剂如阿帕替尼、安罗替尼、舒尼替尼和雷莫芦单抗等,其中阿帕替尼和安罗替尼被纳入中国临床肿瘤学会《食管癌诊疗指南》[21],作为EC的重点治疗药物。研究发现,阿帕替尼治疗晚期EC,可不同程度地缓解患者临床症状,提高患者生活质量,并耐受大多药物相关不良反应[22]。一项随机、双盲、多中心Ⅱ期试验(NCT02649361)纳入165例复发或转移性ESCC患者,按2∶1随机分配到安罗替尼组(n=110)和安慰剂组(n=55),结果显示,安罗替尼组患者中位无进展生存期(progression-free survival,PFS)显著高于安慰剂组(3.0个月 VS 1.4个月,HR=0.46,95%CI=0.32～0.66);安全性评估中,安罗替尼组患者常见Ⅲ/Ⅳ级治疗相关不良事件为高血压(16%)、食欲下降(6%)和低钠血症(4%),其中有3例(3%)患者死亡考虑与药物相关;安慰剂组患者常见不良事件为食欲下降(4%),无治疗相关性死亡发生[23]。但目前临床评估表明,单药治疗效果有限,抗血管生成联合放/化疗或免疫疗法可能取得更好的抗肿瘤疗效。一项单臂、开放标签Ⅱ期试验(NCT03736863)评估阿帕替尼联合PD-1抑制剂卡瑞利珠单抗治疗晚期ESCC疗效,结果显示,患者客观缓解率为34.62%,药物相关不良事件发生率为44.23%[24]。另一试验(ChiCTR-TRC-1800017662)纳入126例患者,评估阿帕替尼联合新辅助化疗(紫杉醇+顺铂)治疗晚期ESCC的疗效及安全性,研究发现,与新辅助化疗组相比,阿帕替尼+新辅助化疗可显著提高ESCC患者总缓解率(80.00%VS54.10%)及病理完全反应率(15.38% VS 4.92%),且两组患者无严重不良事件发生[25]。一项研究纳入65例晚期ESCC患者,对照组(n=34)给予同步放化疗,观察组(n=31)在此基础上给予阿帕替尼联合治疗,发现观察组患者中位PFS(12.0个月 VS7.0个月)及完全缓解率(22.58% VS 2.94%)均明显高于对照组[26]。同时,也有研究探讨阿帕替尼联合化疗对晚期EC患者临床疗效及安全性的影响,将33例患者随机分为紫杉醇治疗组和阿帕替尼+紫杉醇治疗组,该研究中阿帕替尼+紫杉醇可显著提高晚期EC患者临床疗效,表现为中位PFS(175 d VS 85 d)、客观反应率(88.89%VS11.11%)和疾病控制率(93.33% VS 33.33%)均升高;安全性评估中,紫杉醇组常见Ⅲ/Ⅳ级不良事件为贫血(11.11%)和中性粒细胞减少症(5.56%),阿帕替尼+紫杉醇组常见贫血(13.33%)、高血压(6.67%)和蛋白尿(6.67%)[27]。回顾性分析安罗替尼联合同步放疗治疗晚期ESCC患者,研究发现,与同步放疗组相比,安罗替尼+同步放疗组患者中位OS升高(9.0个月 VS 5.0个月,HR=0.58,95%CI=0.34～0.92),总体不良事件发生率减轻[28]。陈辉等[29]发现,安罗替尼联合紫杉醇+顺铂治疗EC患者的总缓解率(85.00% VS 45.00%)、病灶局部控制率(70.00% VS 47.50%)、中位OS(10.85±2.30 VS 9.23±1.61)及PFS(6.81±1.43 VS 5.00±1.23)均高于常规化疗组,而两组患者不良事件发生率无显著差异。研究者纳入98例晚期ESCC患者,将安罗替尼联合PD-1抑制剂治疗分为A组,安罗替尼单药治疗分为B组,研究发现,队列A组患者中位PFS延长(5.4个月 VS 3.0个月),疾病控制率增高(71.74% VS 47.92%);两组患者不良反应事件以Ⅰ/Ⅱ级为主[30]。因此,抗血管生成药物(或联合常规治疗方案)具有良好的抗EC活性及可控的毒性,并显著提高患者临床疗效及安全性。探索更多联合治疗方案,将对改善EC患者预后具有重要意义,可能是晚期EC患者潜在的二线治疗用药。

抗血管生成疗法也有一定的局限性。除了一些可控制的副作用如高血压、肾功能障碍和血栓形成等,抗血管生成药物还可能影响其他化疗药物在体内的扩散。以往认为,抗血管生成治疗可诱导肿瘤血管的结构和功能正常化,使得血流增加并促进细胞毒性药物进入肿瘤组织。而 Van der veldt等[31]使用PET观察到抗血管生成药物可抑制细胞毒性药物向肿瘤部位的运输,这一理论尚需要进一步验证。总的来说,抗肿瘤血管生成能达到更好的治疗疗效,积极研发新的血管生成抑制剂并探索与其他药物联合作用是EC治疗的重点研究工作。

2.2 免疫疗法

EC的免疫微环境复杂多样,肿瘤细胞通过招募多种免疫细胞群或表达抑制性因子以逃避T细胞的杀伤。免疫疗法通过抑制相关通路的表达或提供免疫特异性肿瘤抗原,以恢复免疫系统功能并清除肿瘤细胞。常见的免疫疗法有免疫检查点抑制、DC免疫治疗、嵌合抗原受体T细胞疗法和肿瘤疫苗接种。

PD-1是T细胞常见的免疫检查点,与其配体PD-L1结合抑制T细胞活化和增殖。基于这一原理,阻断PD-1/PD-L1通路的免疫疗法被用于治疗多种恶性肿瘤。目前,关于PD-1/PD-L1抑制剂治疗EC的临床试验正在持续开展中。KEYNOTE-590(NCT03189719)试验评估帕博利珠单抗与安慰剂联合化疗(5-氟尿嘧啶+顺铂)治疗PD-L1≥10晚期EC患者疗效,结果显示,与安慰剂+化疗组相比,帕博利珠单抗+化疗组患者的中位OS(13.9个月VS 8.8个月,HR=0.57,95%CI=0.43～0.75)及PFS(7.5个月 VS 5.5个月,HR=0.51,95%CI=0.41～0.65)延长、治疗相关不良事件发生率增加(71.89% VS 67.57%)[32]。KEYNOTE-975(NCT04210115)研究得出相似结论,提出帕博利珠单抗联合放化疗可有效改善PD-1/PD-L1阳性晚期ESCC患者OS及PFS[33]。一项Ⅲ期试验(NCT03691090)随机将晚期或转移性ESCC患者给予安慰剂或卡瑞利株单抗联合化疗(紫杉醇+顺铂)治疗,结果显示,安慰剂+化疗组患者中位OS及PFS分别为12.0个月和5.6个月,低于卡瑞利株单抗+化疗组患者的15.3个月(HR=0.70,95%CI=0.56～0.88)和6.9个月(HR=0.56,95%CI=0.46～0.68);且卡瑞利株单抗+化疗组患者治疗相关不良事件发生率低于安慰剂组(63.42% VS 67.68%)[34]。JUPITER-06(NCT03829969)试验评估了特瑞普利单抗与安慰剂联合化疗(紫杉醇+顺铂)在晚期ESCC的临床疗效,该研究纳入514例患者,结果显示,与安慰剂+化疗组相比,特瑞普利单抗+化疗可改善ESCC患者中位OS(17.0个月 VS 11.0个月,HR=0.58,95%CI=0.43～0.78)及PFS(5.7个月 VS 5.5个月,HR=0.58,95%CI=0.46～0.74),且两组患者治疗后不良事件发生率相似[35]。ORIENT-15(NCT03748134)研究探讨信迪利单抗联合化疗对PD-L1≥10的晚期或转移性ESCC患者抗肿瘤活性,患者接受信迪利单抗或安慰剂治疗,并分别联合顺铂+紫杉醇或顺铂+5-氟尿嘧啶化疗,结果显示,与安慰剂+化疗组相比,信迪利单抗+化疗组患者的中位OS更高(17.2个月 VS 13.6个月,HR=0.64,95%CI=0.48～0.85),PFS呈现良好趋势(8.3个月 VS 6.4个月,HR=0.58,95%CI=0.45～0.75);安慰剂+化疗组和信迪利单抗+化疗组患者均发生了≥Ⅲ级的严重不良反应事件(59.94% VS 54.52%)[36]。同时,RATIONALE 311(NCT03957590)试验给予替雷利珠单抗联合同步放化疗[37],NCT03958890试验给予斯鲁利单抗联合化疗,为改善晚期或转移性ESCC患者OS和PFS带来了临床获益,且具有可接受的安全性[38]。可见,PD-1/PD-L1抑制剂联合常规治疗作为晚期EC的一线疗法取得了初步成功,并在未来显示了良好的前景。由于PD-L1阳性与EC患者预后不良显著相关,提示PD-L1可作为患者预后生物指标。然而并非所有患者均对PD-1/PD-L1抑制剂敏感,需要寻找其他生物标志物来协助评估患者预后。分析260例ESCC患者发现,粘连蛋白γ2上调可降低抗PD-1治疗效果[39],提示粘连蛋白γ2可能作为EC患者抗PD-1治疗预后差的预测因子。此外,包括错配修复缺陷、肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性在内的肿瘤特异性新抗原已被确定为非小细胞肺癌对PD-1/PD-L1抑制效率的预测[40],但尚未在EC中得到验证。研究表明,综合分析CD8+T细胞丰度、肿瘤突变负荷和PD-1基因表达可能提高EC患者预后评估准确性[41]。因此,联合运用各项指标可能更有效地筛选出EC免疫治疗敏感人群。

树突状细胞(dendritic cells,DC)是重要的抗原提呈细胞,其成熟状态可激活免疫系统,未成熟状态则诱导机体免疫耐受。肿瘤细胞可释放免疫抑制因子,诱导DC未成熟化,促使肿瘤细胞免疫逃逸。基于DC的免疫治疗,在启动有效T细胞抗肿瘤反应中发挥重要作用。Ogasawara等[42]评估WT1肽脉冲DC疫苗联合OK-432用于晚期或复发性EC患者的安全性和可行性,研究发现,患者客观缓解率为20%,疾病控制率为40%,中位OS及PFS分别为7.0个月及4.1个月,且未观察到与疫苗接种相关严重不良事件发生。Wang等[43]团队纳入40例接受放疗的EC患者,其中28例患者在此基础上接种DC疫苗,研究发现,疫苗组患者血清IL-2、IL-12、IFN-γ水平及IFN-γ CD8+T比例升高,患者1 a(82.14% VS 50.00%)及2 a OS(67.86% VS 33.33%)增加,且仅有2例患者出现轻度发热。另一项Meta分析纳入11项研究,包括994例EC患者,探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIK)或DC-CIK免疫治疗在EC中的临床疗效,发现与常规治疗组相比,CIK/DC-CIK免疫治疗组患者IL-12(OR=56.30,95%CI=51.32～61.28)、INF-α(OR=15.10,95%CI=12.31～17.89)、IFN-γ(OR=36.30,95%CI=31.54～41.06)水平及CD3+(OR=9.48,95%CI=6.19～12.77)和CD3-CD56+(OR=6.57,95%CI=2.00～11.14)亚群百分比升高;总缓解率(OR=2.18,95%CI=1.57～3.02)、疾病控制率(OR=3.83,95%CI=2.47～5.92)及1 a OS(OR=2.59,95%CI=1.52～4.40)增加,生活质量提高(OR=1.94,95%CI=1.13～3.22)[44]。以上研究表明,以DC为基础的免疫疗法用于治疗晚期EC患者,可引起特异性免疫反应,提高患者免疫功能及生存结局,且具有安全可行性。研究发现,DC表面可表达共刺激基因PD-L1,通过与T细胞表面PD-1相互作用,减弱效应T细胞抗肿瘤效应[45]。表明沉默或下调DC的PD-L1或T细胞的PD-1,可能增强DC并启动T细胞免疫反应。因此,DC和PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤免疫应答中具有关联作用,基于DC的免疫疗法与阻断PD-1/PD-L1信号通路的联合治疗策略,可能成为未来抗EC治疗的新领域。

嵌合抗原受体T细胞疗法通过基因工程将T细胞改造成嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptors-T,CAR-T),特异性识别并攻击肿瘤细胞。CAR-T细胞疗法常用于白血病和淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤的治疗。近年来,CAR-T细胞也被探索用于治疗实体肿瘤,包括EC。肝细胞受体A2和人表皮生长因子受体2在EC中高表达,是CAR-T细胞治疗的常见靶点[46]。这种CAR-T细胞疗法能释放高水平的促炎细胞因子,并有效识别、结合和破坏EC细胞系,在临床前研究中显示出了抗肿瘤作用。然而CAR-T细胞疗法在EC患者中的临床试验尚无报道。通过修改CAR-T细胞的结构域,获得了更强特异性、持久性的新一代CAR-T细胞,其在EC小鼠模型体内存活时间更长[47],意味着可能具有持续的抗肿瘤能力。关于CAR-T细胞疗法在EC中的作用需要进一步研究。

肿瘤-睾丸抗原(cancer-testis antigens,CTA)是EC中高表达的肿瘤相关抗原,包括纽约食管鳞状细胞癌1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1,NY-ESO-1)、酪氨酸和苏氨酸蛋白激酶(tyrosine and threonine protein kinase,TTK)、黑色素瘤相关抗原-A和CTA-2[48]。肿瘤疫苗通过这些特定的抗原诱导免疫反应,刺激细胞毒性T淋巴细胞识别并攻击肿瘤细胞。NY-ESO-1在晚期ESCC患者的Ⅰ期临床试验中显示出了可靠的安全性和免疫原性,为多肽疫苗治疗EC的临床研究提供了基础保障[49]。一项晚期EC的II期临床试验中,针对包含TTK、淋巴细胞抗原6复合体位点K和胰岛素样生长因子-IImRNA结合蛋白3的多肽组合疫苗进行检测,发现肿瘤疫苗诱导人类白细胞抗原基因(HLA-A+2402)依赖的免疫应答与更好的预后相关[50]。肿瘤疫苗疗法可能为EC患者提供益处,然而目前尚未正式应用于临床,其强大而特异的抗肿瘤疗效还有待继续探索。

3 总结

近年来,随着人们对TME和靶向TME治疗的深入了解,抗血管生成药物、PD-1/PDL1抑制剂和DC免疫治疗已投入临床使用,并显示出良好的抗EC疗效。新的免疫疗法,如CAR-T细胞疗法和肿瘤疫苗接种在临床前试验中也显示出初步的治疗价值。然而,现有的治疗方案仍存在许多局限性,不足以完全治愈恶性肿瘤。增强现有药物的有效性,如使用生物标志物来识别药物敏感的EC患者或联合用药以增强治疗疗效,是延长患者OS的最直接方法。未来仍需不断探索TME在EC中的作用,为有效抗EC治疗提供指导方案。